Ion Torrent推出僅需6個(gè)小時(shí)的AmpliSeq Exome試劑

Life Technologies旗下Ion Torrent推出外顯子組捕獲試劑，該試劑采用了AmpliSeq技術(shù)，將工作流程時(shí)間減至6小時(shí)（含1小時(shí)手控時(shí)間），并能進(jìn)行50毫微克的樣本輸入。

作為早期使用用戶，Selah Genomics基因組服務(wù)部副總裁Jeremy Stuart告訴《測(cè)序》期刊，其仍在對(duì)試劑的數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，經(jīng)過(guò)初檢，該試劑“表現(xiàn)符合預(yù)期”。 從工作流程來(lái)看，該試劑“操作簡(jiǎn)單、使用方便”。

Stuart補(bǔ)充說(shuō)，采用其他外顯子組捕獲試劑需要2至3天才能制作出文庫(kù)，而使用該試劑，Selah的研究人員能在一天之內(nèi)就制作出文庫(kù)�！昂翢o(wú)疑問(wèn)，該試劑更快捷、更省力”， Stuart說(shuō)。

Stuart表示，下一步是將AmpliSeq外顯子組捕獲試劑與混合使用的試劑,如Agilent（安捷倫）的SureSelect試劑或HaloPlex試劑以及, Life Tech將后續(xù)提供的，用于Ion的TargetSeq外顯子組捕獲試劑進(jìn)行比較。

Life Tech不是唯一一家力圖解決周轉(zhuǎn)時(shí)間和限制外顯子組捕獲樣本輸入等問(wèn)題的公司。Agilent（安捷倫）和Illumina均分別研發(fā)出試劑，以解決上述問(wèn)題。使用Agilent（安捷倫）HaloPlex試劑的用戶報(bào)告說(shuō)，該試劑需要3天的周轉(zhuǎn)時(shí)間，是使用SureSelect試劑時(shí)間的一半，最初可以輸入200毫微克樣本（IS 3/19/2013）。 同時(shí)，Illumina聲稱其Nextera Rapid Capture Exome試劑能夠在1.5天內(nèi)對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行樣本制備和外顯子組富集捕獲，以及進(jìn)行50毫微克DNA輸入。

AmpliSeq Exome試劑含有300,000個(gè)擴(kuò)增子，可以復(fù)用到12個(gè)具有24,000個(gè)擴(kuò)增子的擴(kuò)增子池。 這12個(gè)擴(kuò)增子池分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR反應(yīng)，隨后組合成單一反應(yīng)，此時(shí)，也進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的AmpliSeq反應(yīng)，Life Tech產(chǎn)品營(yíng)銷部高級(jí)主管Andy Felton告訴IS。

在研制外顯子組試劑時(shí)，主要的技術(shù)障礙是在保持均勻覆蓋的同時(shí)復(fù)用24,000個(gè)擴(kuò)增子，F(xiàn)elton補(bǔ)充說(shuō)。我們尚不需要對(duì)AmpliSeq文庫(kù)制備做重大改變，公司僅需對(duì)文庫(kù)制備的One Touch II機(jī)器進(jìn)行優(yōu)化，并稍微改進(jìn)部分生物學(xué)信息，以確保能對(duì)變異進(jìn)行準(zhǔn)確分析，F(xiàn)elton解釋說(shuō)。

保持均勻覆蓋的一項(xiàng)關(guān)鍵之處在于確保緊挨的擴(kuò)增子處于不同的擴(kuò)增子池中，F(xiàn)elton說(shuō)，“當(dāng)我們繪制特定基因時(shí)，我們希望獲得最佳的覆蓋率，因此，必須將彼此緊挨的擴(kuò)增子分離至單獨(dú)的擴(kuò)增子池”。 這與公司在其他AmpliSeq面板中使用的原理相同，但是，“由于達(dá)成24,000-個(gè)擴(kuò)增子叢和300,000對(duì)擴(kuò)增子引物，這使AmpliSeq Exome試劑更上一層樓”，F(xiàn)elton補(bǔ)充說(shuō)。

12個(gè)擴(kuò)增子池分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR反應(yīng)，隨后匯集在同一池中。

Felton解釋說(shuō)，如果用戶在Ion Proton PI芯片上運(yùn)行兩個(gè)外顯子組，各反應(yīng)的試劑成本約750美元，包括外顯子組捕獲、文庫(kù)試劑、模板試劑、測(cè)序試劑和芯片。如果用戶購(gòu)買(mǎi)了進(jìn)行48個(gè)反應(yīng)的試劑，則各反應(yīng)將花費(fèi)400美元左右。

Felton說(shuō)，當(dāng)在PI芯片上運(yùn)行單個(gè)外顯子組時(shí)，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫(kù)，以及以20倍的速度覆蓋96%的文庫(kù)。 此外，0.2倍平均覆蓋率范圍內(nèi)的文庫(kù)覆蓋率高達(dá)90%。

對(duì)于在一個(gè)芯片上運(yùn)行兩個(gè)外顯子組的用戶而言，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫(kù)，以及以20倍的速度覆蓋94%的文庫(kù)。如運(yùn)行三個(gè)外顯子組，則該試劑可以以10倍的速度覆蓋94%的文庫(kù)，以及以20倍的速度覆蓋88%的文庫(kù)。

這便于用戶在孟德?tīng)栄芯恐性趩蝹�(gè)PI芯片上運(yùn)行三個(gè)外顯子組，或者運(yùn)行一個(gè)外顯子組以獲得更高的覆蓋率，F(xiàn)elton解釋說(shuō)。

從DNA到外顯子組注釋變異的整個(gè)工作流程可以在兩天內(nèi)完成，其中，外顯子組文庫(kù)制備需6個(gè)小時(shí)，測(cè)序時(shí)間為3小時(shí)，F(xiàn)elton補(bǔ)充說(shuō)。

Selah Genomics的Stuart表示，截至目前，公司已采用該試劑制作了8個(gè)外顯子組文庫(kù)。 盡管其尚未完成數(shù)據(jù)分析，到目前為止，覆蓋情況良好，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率高達(dá)90%。 此外，“以20倍或更高倍的速度進(jìn)行覆蓋，覆蓋率也在90%的范圍內(nèi)”， Stuart說(shuō)，其目前正在外顯子組數(shù)據(jù)中尋找一種適合的質(zhì)量指標(biāo)。

Stuart表示，該試劑操作簡(jiǎn)單、方便快捷，非常具有吸引力。

“如涉及我們希望開(kāi)展的外顯子組測(cè)序數(shù)量，限制因素之一通常在于工作流程和費(fèi)用”， Stuart補(bǔ)充說(shuō)，“就工作流程而言，[采用AmpliSeq Exome試劑]，目前我們已可以開(kāi)始處理大量樣本”。

由于Selah Genomics的研究人員已經(jīng)有過(guò)使用其他Ion AmpliSeq面板的經(jīng)驗(yàn)，因此，轉(zhuǎn)為采用AmpliSeq Exome時(shí)并無(wú)困難，Stuart說(shuō)。

與采用混合試劑進(jìn)行外顯子組測(cè)序的方法相比，擴(kuò)增子法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在輸入數(shù)量很小，約100毫微克，Stuart說(shuō)。 此外，擴(kuò)增子法僅需進(jìn)行一次擴(kuò)增——盡管Ion提供了進(jìn)行二次擴(kuò)增的機(jī)會(huì)——而混合法卻需要進(jìn)行兩次擴(kuò)增。

Stuart表示，其將把AmpliSeq Exome試劑主要用于腫瘤應(yīng)用中。最初，Stuart將該試劑用于尋找胚系突變。但是，最終其對(duì)在同一芯片上運(yùn)行腫瘤和正常外顯子組以尋找罕見(jiàn)的體細(xì)胞突變倍感興趣。

Stuart說(shuō)，在推出AmpliSeq Exome試劑后，其計(jì)劃將AmpliSeq Exome試劑與Proton PII芯片結(jié)合使用，這將“為同時(shí)運(yùn)行腫瘤和正常外顯子組以及檢測(cè)罕見(jiàn)的體細(xì)胞突變提供了契機(jī)”。

除Ion Proton外，Selah Genomics還運(yùn)行了Ion Torrent PGM、Illumina的MiSeq、454 GS FLX和 Pacific Bioscience的RS。

Stuart表示，Selah Genomics主要關(guān)注腫瘤學(xué)和病毒學(xué)。Selah Genomics使用Proton運(yùn)行AmpliSeq的綜合癌癥面板，并根據(jù)AmpliSeq的熱點(diǎn)面板發(fā)起一項(xiàng)名為“PrecisionPath”的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)測(cè)試。 公司已與南卡羅來(lái)納州的格林維爾醫(yī)療系統(tǒng)公司（Greenville Health System）開(kāi)展合作，以向癌癥患者提供該項(xiàng)測(cè)試(CSN 5/8/2013)。

此外，Selah還通過(guò)使用PGM和MiSeq進(jìn)行伴隨試驗(yàn)，為制藥公司的臨床試驗(yàn)提供支持，Stuart補(bǔ)充說(shuō)。

Stuart表示，實(shí)驗(yàn)室自5月起購(gòu)入Proton，每次運(yùn)行通常產(chǎn)生8到11千兆堿基，基本與其他用戶報(bào)告的數(shù)量相等（IS 2/26/2013）。 當(dāng)一次運(yùn)行兩個(gè)外顯子組文庫(kù)時(shí)，以20倍或更高倍速度對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行的覆蓋，覆蓋率可高達(dá)近90%，Stuart說(shuō)，“這使得我們能一次運(yùn)行一對(duì)外顯子組，胚系突變也得到充分覆蓋”。