MD公司QPix400系列微生物篩選系統(tǒng)加速生物能源發(fā)展

上世紀(jì)70年代以來，受傳統(tǒng)能源價格、環(huán)保及資源有限等因素的影響，世界各國日益重視可再生綠色能源，如太陽能、風(fēng)能、水能和生物能的開發(fā)和利用。如我國最近大部份地區(qū)出現(xiàn)的霧霾天氣就是由傳統(tǒng)能源的過度使用而造成的，如何盡快轉(zhuǎn)變能源供給模式，將藍(lán)天還給人民，就擺在了我國科研工作者面前。其中各種替代方法中，以利用生物基質(zhì)（植物、微生物等）開發(fā)出的各種生物燃料所帶來的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益越來越受到大家廣泛的關(guān)注。生物燃料泛指由各種植物或微生物資源可轉(zhuǎn)化為固體 、液體或氣體形式的一種燃料，具有良好的可貯藏性和易運(yùn)輸性。然而，傳統(tǒng)方法是使用各種糧食來生產(chǎn)生物燃料（如乙醇），被稱之為第一代生物燃料，但是此方法有其不可避免的缺陷，首先燃料乙醇作為汽油替代品，其水溶性、揮發(fā)性、熱值低等缺點制約著其大規(guī)模使用，其次以糧食作為原料生產(chǎn)燃料乙醇的這種方法也備受爭議（圖一）。

因此各國科學(xué)家都開始研究可替代的先進(jìn)生物燃料，先進(jìn)生物燃料(Advanced biofuel)是指以高產(chǎn)非糧作物、農(nóng)林廢棄物、其他可持續(xù)性生物質(zhì)或者藻類為原料，通過化學(xué)、物理、生物甚至必要的組合技術(shù)，轉(zhuǎn)化獲得的具有與化石燃料相當(dāng)甚至更高能量密度，易于儲存和運(yùn)輸?shù)娜剂戏肿�。先進(jìn)生物燃料研究目前有兩個方向， 其一是通過改造微生物代謝途徑而直接生產(chǎn)可被利用的生物燃料，如美同加州大學(xué)洛杉磯分校學(xué)者通過合成生物學(xué)手段改造大腸桿菌Escherichia coli氨基酸生物合成途徑，合成了一系列碳鏈稍長的醇類化合物，并且大幅度提高了產(chǎn)量，為生物汽油發(fā)展提供了新思路；其二是針對傳統(tǒng)微生物（如大腸桿菌、酵母菌等）改造，使其能夠合成特異性酶類分解纖維素，從而生產(chǎn)生物燃料；如前些年美國麻省理工學(xué)院的一個學(xué)生研究小組發(fā)明了一種用微生物產(chǎn)生的酶類來分解廢棄植物纖維產(chǎn)生電能的生物燃料電池，它可專門用來為手機(jī)充電。眾所周知纖維素是地球上最豐富的可再生自然資源，例如我國每年僅作為秸稈的纖維素產(chǎn)量就達(dá)2億噸以上，那么如果將如此豐富的自然資源轉(zhuǎn)化為生物燃料將是一種不錯的選擇。

 

我們知道有些纖維素具有很強(qiáng)的抗降解屏障，而傳統(tǒng)化學(xué)降解的方法需要強(qiáng)酸和高溫的一個環(huán)境，即污染了環(huán)境又增加工業(yè)生產(chǎn)成本，而采用纖維素降解酶的方法與化學(xué)降解方法相比較具有很多優(yōu)勢，但是目前也存在很多有待解決的問題，如有些纖維素酶由于其熱穩(wěn)定性差、pH耐受范圍較窄以及活性低而無法滿足不同工業(yè)應(yīng)用需求，需要挖掘具有高活性和穩(wěn)定性的新纖維素酶，很多能夠篩選出的具有高生物活性和高穩(wěn)定性的纖維素酶的細(xì)菌、放線菌或真菌（圖二），但在實驗室條件下很難進(jìn)行純培養(yǎng)。如何有效彌補(bǔ)某些微生物在無法適應(yīng)實驗室環(huán)境下進(jìn)行純培養(yǎng)呢？

 

 

環(huán)境微生物基因組，也稱之為宏基因組，通過對其篩選能夠有效的幫助我們解決上述問題。宏基因組學(xué)誕生于上世紀(jì)90年代，是指不經(jīng)過微生物培養(yǎng)階段，采用直接提取環(huán)境中總DNA的方法（目前主要指環(huán)境中細(xì)菌和真菌基因組總和），對微生物基因總和進(jìn)行研究的一門新學(xué)科。宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)，使得人們對占微生物總體99% 以上不可純培養(yǎng)的微生物的研究成為現(xiàn)實。它的應(yīng)用主要有兩方面：一方面是篩選功能基因, 開發(fā)具有所需功能的蛋白，另一方面是通過對宏基因組文庫進(jìn)行分析, 探討在各種環(huán)境下微生物間相互作用和微生物與周圍環(huán)境間相互影響的規(guī)律。在宏基因組技術(shù)的應(yīng)用范圍被不斷擴(kuò)展的同時, 圍繞著宏基因組文庫的構(gòu)建、篩選、測序和分析等方面的研究已成為宏基因組學(xué)發(fā)展的主要推動力。文庫的構(gòu)建的方法是在環(huán)境樣品中提取基因組DNA，根據(jù)序列的大小將其克隆到合適的載體（質(zhì)粒、粘�；蛘呒�(xì)菌的人工染色體中），可導(dǎo)入不同的宿主菌體（如大腸桿菌、鏈霉菌或假單胞菌）中，來篩選出目的轉(zhuǎn)化子。我們知道一個好的基因組文庫的大小應(yīng)足夠大，以便包括所有的基因DNA 順序，目前很多用戶采用傳統(tǒng)人工轉(zhuǎn)化培養(yǎng)、挑選克隆方式，這種方式有些不可避免的缺陷，首先其增加勞動人員的工作量，其次由于人為原因可能出現(xiàn)誤挑、挑選出的克隆來源無法追蹤，工作效率低等。往往我們挑選成千上萬的單克隆后，僅能獲得幾個具有活性的克隆。如何提高陽性克隆篩選效率和準(zhǔn)確性，使實驗人員從簡單重復(fù)的勞動中解放出來，成為了大家關(guān)注的焦點。

 

1991年成立于英國Genetix公司一直致力于高通量全自動微生物克隆篩選系統(tǒng)的研究和開發(fā)，并于1993年推出了世界上第一臺QPix高通量全自動微生物篩選系統(tǒng)。經(jīng)過二十年的發(fā)展，目前QPix系統(tǒng)在全球有超過600臺的裝機(jī)量，因此它也建立了微生物克隆篩選方面的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，已知世界八大測序中心，其中有七家采用了QPix系統(tǒng)，2011年Genetix公司加入Molecular Devices公司，而后Molecular Devices根據(jù)市場的需要，研發(fā)并推出了最新Qpix 400系列高通量全自動微生物篩選系統(tǒng)，目前包括QPix460、Qpix450和QPix420高中低三種型號（圖三）。

 

圖三：QPix460高通量全自動微生物克隆篩選平臺 

 

QPix460能夠幫助實驗人員完成從轉(zhuǎn)化涂板、克隆篩選、文庫復(fù)制重排等全部工作。QPix400系列產(chǎn)品采用了最新的磁懸浮傳動裝置，可以有效的提高篩選速度和精確性，QPix400系列高通量全自動篩選系統(tǒng)每天可以挑選30000克隆，而傳統(tǒng)人工方式一人一天最多挑選2000個克隆。且QPix高通量微生物篩選系統(tǒng)也采用了特殊金屬材質(zhì)的挑針（圖四），優(yōu)勢之一是具有較高的強(qiáng)度和壽命、利于挑針的清洗消毒、又能提高挑選精度和準(zhǔn)確性（精度＜10um、準(zhǔn)確性＞98%）；優(yōu)勢二既有針對不同微生物類型挑針，如有針對大腸桿菌、酵母菌和噬菌體的挑針，也有針對不實驗方法的挑針，如挑選挑針、復(fù)制挑針、點膜挑針等。

 

 

QPix400系列產(chǎn)品中加入了條形碼讀取器和培養(yǎng)基高度自動檢測功能（圖五），其中條形碼讀取器可以幫助用戶在建庫的時方便數(shù)據(jù)記錄和追蹤，而高度自動檢測功能的原理是利用了超聲波探測技術(shù)，能準(zhǔn)確探測出培養(yǎng)基的高度，可對挑針Z軸的高度進(jìn)行優(yōu)化。

 

 

目前大家普遍利用含有剛果紅染料的羧甲基纖維素（CMC）瓊脂作為培養(yǎng)基，通過宏基因組學(xué)篩選方法已經(jīng)成功的從各種土壤、水牛瘤胃和白蟻后腸中，獲得了幾株有活性的纖維素酶。然而CMC篩選的方法缺點是不適合高通量篩選、且不能定量及信噪比差等缺點。也報道過其它一些方法，但是多數(shù)以瓊脂平板作為試驗的基質(zhì)，并不能適合大片段基因組庫的高通量篩選。Mewis K等發(fā)表在Microbiology and Immunology的一篇文章中提到了利用二硝基酚（DNP）作為纖維素酶底物來顯色的方法，他們將文庫克隆在pCC1拷貝控制福斯質(zhì)粒載體上，通過增加拷貝數(shù)目來增加檢測靈敏度，此方法可一步顯色后，利用具有光吸收功能的酶標(biāo)儀檢測其吸光度變化，這種檢測方法具有可定量、靈敏度高及全自動化優(yōu)勢。在進(jìn)行檢測以前，首先將構(gòu)建好的文庫（N塊384孔板，-80℃取出。放在37℃半小時左右）然后將整板的384孔板進(jìn)行復(fù)制，傳統(tǒng)手工方法效率很低，他們利用了Molecular Devices公司的QPix高通量全自動微生物克隆篩選系統(tǒng)所具有的微孔板復(fù)制功能，專用的復(fù)制挑針，復(fù)制挑針模塊有兩種不同的規(guī)格，96根針或384根針，分別對應(yīng)96孔板或者384孔板，其中96根挑針模塊也可以兼容384孔板。如復(fù)制10塊384板孔（384根針挑頭），復(fù)制完畢只需要15分鐘，大大提高了勞動效率。

 

如篩選出各種酶類都需要進(jìn)行酶活力評價，傳統(tǒng)方式準(zhǔn)確率、效率都較低。酶活力評價法就可以利用熒光法作為一種手段，其具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，將熒光標(biāo)記物與目標(biāo)基因構(gòu)建于表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，根據(jù)熒光強(qiáng)度高低選擇克隆，傳統(tǒng)方式需人工在熒光顯微鏡下進(jìn)行克隆挑選，工作強(qiáng)度大，QPix400系列高通量全自動微生物克隆篩選系統(tǒng)不但具有亮視場白光成像功能，同時還具有多通道熒光成像功能，這樣會大大縮短酶活力評價過程，提高效率(圖六)。

 

 

生物燃料作為一種全新能源具有無可比擬的優(yōu)勢，如何加快生物燃料的研發(fā)，促進(jìn)其適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，關(guān)鍵是如何在較短時間內(nèi)快速找到特異性、高產(chǎn)量的微生物，可加速生物燃料發(fā)展，高通量篩選儀器作為一種必不可少手段會發(fā)揮出越來越大的優(yōu)勢。