伯豪客戶《Cell Research》發(fā)表單細(xì)胞測序最新成果

背景介紹

     在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，外部刺激通過背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）的假單極感覺神經(jīng)元（Pseudo-unipolar sensory neurons）傳遞到脊髓（Spinal cord）中。小的DRG可以通過無髓鞘的軸突（Un myelinated axons，C-fibers）和薄髓鞘的軸突（thinly myelinated axons，Aδ-fibers）傳遞從神經(jīng)末梢（Peripheral nerve terminals）發(fā)生的疼痛感、溫度和機(jī)械感受信號至脊髓的I-II層。大的DRG則通過厚髓鞘的軸突（thickly myelinated axons，Aβ-fibers）傳遞機(jī)械感受信號和本體感覺信號至脊髓的III-V層。DRG在信號傳遞的過程中發(fā)揮了重要的作用。盡管在之前文獻(xiàn)中，已經(jīng)有通過芯片和RNA測序的手段對DRG的基因表達(dá)有所研究，并且鑒定到了一些神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（Neuromodulators）的表達(dá)，如：尿鈉排泄肽B（Natriuretic peptide B，NPB）和Na+，K+-ATPase（NKA），但卻并沒有對單個神經(jīng)元提供全方位的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況的介紹。

     最近，有多個工作已經(jīng)對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析，如：TRPV1世系和Nav1.8通道表達(dá)DRG神經(jīng)元的RNA-seq。在單細(xì)胞測序（Single-cell RNA-seq）方面，Chiu等鑒定到了6個DRG神經(jīng)元的亞家族。相比于普通的轉(zhuǎn)錄組測序，單細(xì)胞測序可以使人們對單一細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序有更深入的了解。在神經(jīng)生物學(xué)的研究中，由于神經(jīng)元相對其他組織細(xì)胞而言具有高度的異質(zhì)性（Heterogeneity），因此普通轉(zhuǎn)錄組測序不能夠滿足人們對神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的研究。單細(xì)胞測序可以逐個對單個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析，因此在神經(jīng)生物學(xué)的研究中具有廣泛的應(yīng)用。Usockin等按照傳統(tǒng)模式，對小鼠DRG進(jìn)行的低覆蓋度的單細(xì)胞測序?qū)�DRG分為了11個不同類型。雖然這些工作對感覺神經(jīng)元的研究有重要意義，但是卻并不全面。

    上海生命科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張旭院士聯(lián)合生物芯片上海國家工程研究中心、上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞研究所、上�？萍即髮W(xué)以及徐匯區(qū)中心醫(yī)院利用高覆蓋度的單細(xì)胞測序技術(shù)以及體內(nèi)膜片鉗（in vivo patch clamp）技術(shù)，按照轉(zhuǎn)錄模式、分子標(biāo)記以及功能注釋將小鼠DRG分為了10個大類和14個小類，還發(fā)現(xiàn)了一個新的軀體感覺受體種類。作者還認(rèn)為目前對分子功能以及信號網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以部分的預(yù)測不同神經(jīng)元的功能。該成果已經(jīng)發(fā)表在了2015年12月的國際著名期刊Cell Reasarch（影響因子11.981）上。該研究中單細(xì)胞測序服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

1. 神經(jīng)元樣本和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控

    研究人員首先利用融合IB4的CGRP，NF200熒光標(biāo)記物對神經(jīng)元進(jìn)行免疫染色（Immunostaining）。結(jié)果表明，～35%的神經(jīng)元能被IB4染色，～41.2%被CGRP染色，～46.4%被NF200染色（圖1A）。大約20%被IB4染色的神經(jīng)元能夠表達(dá)CGRP，然而只有5.6%表達(dá)NF200。大約28%被CGRP染色的神經(jīng)元表達(dá)NF200。極少數(shù)可以同時被三個染色。

    為了提高對神經(jīng)元細(xì)胞分類的效率，研究人員設(shè)計了一個專門針對DRG分類的方法。首先，DRG細(xì)胞被從小鼠體內(nèi)分離出后再利用IB4對其染色（圖1B）。顯微鏡下，那些周圍沒有衛(wèi)星細(xì)胞的被選擇用來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序文庫一共來源于19個小鼠的203個神經(jīng)元。

    為了獲得可靠的單神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員首先通過預(yù)實驗對測序的深度和檢測基因數(shù)量進(jìn)行分析，并且確認(rèn)了在維持測序質(zhì)量的前提下，每個樣本至少3000萬的reads作為合理的最小測序量。最終，研究人員每個樣本的平均測序量達(dá)到了5820萬（2960萬－1.064億）（圖1C）。檢測到的基因數(shù)量范圍在7972-13960個之間（圖1D）。為了評估測序深度和基因數(shù)量之間的關(guān)系，研究人員還對其中6個文庫進(jìn)行了重新測序，平均測序量達(dá)到了1.81億個reads。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和深度測序相比，同一文庫的相似度為99.8%（圖1E）。

     最后，為了確認(rèn)RNA-seq的質(zhì)量，研究人員將同一文庫的cDNA等量分成兩份再一次進(jìn)行了RNA-seq，兩次測序的匹配度達(dá)到了99.4%。

2. 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定基因模塊（Gene module）

    研究人員對197個單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析�；�因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）常被用于對有關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行模塊分類。由于在該分析模式下，同一個細(xì)胞簇中有著高度關(guān)聯(lián)的基因，因此這對細(xì)胞分類頗為有用。使用WGCNA方法，研究人員在2043個差異表達(dá)基因中鑒定到了12個基因模塊（圖1G）。

      原位雜交（In situ hybridization, ISH)實驗確認(rèn)了該結(jié)果的可靠性（圖1H）。

3. 基于神經(jīng)元大小的分級成簇分析（Neuron size-based hierarchical clustering）揭示了10個細(xì)胞簇

    研究人員還將197個神經(jīng)元中1745個差異表達(dá)基因進(jìn)行基本的分析來對神經(jīng)簇進(jìn)行歸類（圖2A），一共將其分為10個種類，分別為C1-C10�；�于對1745個差異基因的細(xì)胞－細(xì)胞關(guān)聯(lián)矩陣（cell-cell correlation matrix）分析，C9神經(jīng)元被認(rèn)為高度關(guān)聯(lián)(value of Spearman correlation (VSC): 0.780±0.007) 。 

圖1:神經(jīng)元樣本，RNA測序以及基因分類

4. 14個神經(jīng)元亞簇和雜交狀態(tài)

      根據(jù)簇的分類，C1，C2，C4，C5，C，C8以及C9還可以被分為兩個亞簇，總共14個亞簇（圖2A，3A）。以C4為例，C401表達(dá)Mrgpra3基因，而C4-2同時表達(dá)Mrgpra3基因與Mrgprb4基因。單細(xì)胞定量PCR以及原位雜交實驗同樣確認(rèn)了C4-2的存在（圖3B-D）。Mrgpra3基因與Mrgprb4基因盡管同在C4-2中被檢測到，但共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)卻沒有任何交集（圖3E）。

5. 神經(jīng)元簇中的差異基因

    研究人員使用了Fisher檢測來鑒定神經(jīng)元簇和亞簇中的差異基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1包含了高表達(dá)的Tac1和Calca基因，然而C2中Nppb有高表達(dá)。C1與C2的比較中發(fā)現(xiàn)了152個差異表達(dá)的基因，其中83個在C1中高表達(dá)。另外，研究人員還對其余的神經(jīng)元簇和亞簇進(jìn)行了差異基因的分析。

6. 神經(jīng)元簇的標(biāo)志物

    一個合格的標(biāo)志基因的先決條件需要具備可選擇性，高表達(dá)以及可實驗性。Gal，Nppb，Th以及Mrgpra3被認(rèn)為是C1，C2，C3和C4的標(biāo)志物（圖4A）。每個簇可以有多個標(biāo)志物，如Nts，Il31ra以及Htr1f同時作為C2的標(biāo)志物（圖4B），Cadps2，Baiap2l1和Necab2同時作為C9的標(biāo)志物（圖4C）等等。原位雜交實驗確認(rèn)了該結(jié)果的準(zhǔn)確性（圖4F，G）。

7. 神經(jīng)元簇的功能表型

   研究人員為了確認(rèn)鑒定的14個神經(jīng)元亞簇具有不同的生物學(xué)功能，還對其進(jìn)行了各個條件的無差異性分析（圖5），確認(rèn)了不同神經(jīng)元亞簇在接受信號過程中表現(xiàn)出不同的表型具備不同的功能。

原文出處
Li CL, Li KC, Wu D, Chen Y, Luo H, Zhao JR, Wang SS, Sun MM, Lu YJ, Zhong YQ, Hu XY, Hou R, Zhou BB, Bao L5, Xiao HS, Zhang X. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.Cell Res. 2015 Dec 22.