2018基因編輯學(xué)術(shù)研討會即將在京召開

基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9自2013年被《科學(xué)》列為年度十大科技進(jìn)展之一后，始終保持高速發(fā)展，在Google學(xué)術(shù)上，CRISPR/Cas9相關(guān)的文獻(xiàn)已經(jīng)超過51700篇。為集中展示國際前沿及國內(nèi)前沿的基因編輯技術(shù)，3月30~31日，由北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室主辦的2018基因編輯學(xué)術(shù)研討會將在京舉行。

 

過去的一年中，基因編輯領(lǐng)域繼續(xù)保持高速發(fā)展，比如：可以終止基因編輯過程的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)；操縱Cas9的REC3結(jié)構(gòu)域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)；CRISPR基因編輯結(jié)合離體器官構(gòu)建技術(shù)可以幫助檢測遺傳性癌癥特異性DNA缺陷；CRISPR裝備噬菌體可以讓“超級細(xì)菌”自殺等。

 

2018基因編輯學(xué)術(shù)研討會將涉及多基因、大片斷基因編輯，單堿基編輯, 在RNA水平進(jìn)行修復(fù)的“REPAIR”系統(tǒng)，基因編輯抑制劑與CRISPR/Cas9的配合，如何降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，不依賴于DNA雙鏈斷裂的新型腺嘌呤堿基編輯器，利用CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)新型藥物篩選工具等主題，眾多一線科研工作者將聚集于此共襄學(xué)術(shù)盛宴。

 

2018年3月30 上午
周德敏	北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室	Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-Threatening Viruses as Precision Therapeutics
王艷麗	中科院生物物理研究所	Cas13a切割RNA的分子機(jī)制
吳強(qiáng)	上海交通大學(xué)	開發(fā)DNA大片段編輯技術(shù)研究染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)
魏文勝	北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院	High-throughput functional genomics
王永明	復(fù)旦大學(xué)	建立高效的CRISPR/Cas9編輯技術(shù)
2018年3月30 下午
楊輝	中科院上海生科院神經(jīng)科學(xué)研究所	基因編輯在疾病模型建立及疾病治療中的應(yīng)用
常興	上海生命科學(xué)研究院	利用靶向性胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行基因編輯
陳崇	四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室	基因編輯在腫瘤機(jī)制研究中的應(yīng)用
黃強(qiáng)	復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院	CRISPR-Cas9的DNA剪切活性結(jié)構(gòu)研究
2018年3月31 上午
裴端卿	中科院廣州健康研究院	基因編輯技術(shù)在人口健康領(lǐng)域的應(yīng)用（暫定）
馬燕琳	海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院	基因編輯與生殖健康
周峰	復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院	利用dcas9和超高靈敏度蛋白質(zhì)譜平臺構(gòu)建位點特異DNA-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)
高紹榮	同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院	Generation of animal models for studying human reproduction failure
朱潔	廣州市婦女兒童醫(yī)療中心	CRISPR-Cas9介導(dǎo)的光感受器細(xì)胞重編程治療視網(wǎng)膜色素變性
2018年3月31 下午
朱健康	中科院上海生科院植物逆境生物學(xué)研究中心	植物基因組編輯技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用
牛昱宇	昆明理工大學(xué)	靈長類基因編輯與疾病模型的研究
王皓毅	中科院動物研究所	CRISPR-Cas9在動物模型構(gòu)建、T細(xì)胞治療以及基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用
張淑君	華中農(nóng)業(yè)大學(xué)	建立和利用豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9技術(shù)篩選鑒定豬流感病毒感染相關(guān)的宿主（豬）基因

 

 

CRISPR-Cas9在動物模型構(gòu)建、T細(xì)胞治療以及基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用
高效精確的基因工程技術(shù)對于發(fā)展基因治療，建立細(xì)胞和動物疾病模型具有極為重要的價值。近年來特異性定點核酸酶的研究取得了長足的進(jìn)步。為了突破傳統(tǒng)基因打靶方法的局限，我們率先通過受精卵注射CRISPR-Cas9一步獲得多基因敲除的小鼠。為了取代低通量且技術(shù)要求極高的顯微注射技術(shù)，我們建立了受精卵電擊的方法，從而極大簡化了動物模型的構(gòu)建。這一系列工作大大提高了基因修飾小鼠構(gòu)建效的率和速度，為疾病和發(fā)育生物學(xué)的體內(nèi)研究提供了重要的工具。同時我們在原代T細(xì)胞和表達(dá)嵌合性抗原受體的T細(xì)胞（CART）中建立了高效的單基因和多基因敲除技術(shù)，為細(xì)胞免疫治療研究提供了工具。除了基因編輯，我們也基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立了新技術(shù)，用來調(diào)控基因的表達(dá)水平和表觀遺傳修飾狀態(tài)。

 

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物抗免疫防御系統(tǒng)，是近年來發(fā)現(xiàn)的由小分子RNA介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類，Cas13a是第二大類VI型系統(tǒng)中的效應(yīng)蛋白，亦稱C2c2，具有RNA介導(dǎo)的RNA酶切活性，是目前第二大類CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的唯一能夠降解RNA的蛋白，在RNA技術(shù)中具有潛在的應(yīng)用價值，對開發(fā)研究RNA工具，擴(kuò)展CRISPR系統(tǒng)在基因編輯方面的運(yùn)用具有重大價值。
為了研究Cas13a如何被激活來切割RNA，我們解析了與crRNA及其靶RNA結(jié)合的Leptotrichia buccalis（Lbu）Cas13a的晶體結(jié)構(gòu)，以及LbuCas13a-crRNA復(fù)合物的cryo-EM結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果揭示了crRNA-靶RNA雙鏈體結(jié)合在核酸酶（NUC）葉片的帶正電的中心通道中，并且Cas13a蛋白和crRNA在靶RNA結(jié)合后發(fā)生顯著的構(gòu)象變化。指導(dǎo)目標(biāo)RNA雙鏈體形成觸發(fā)HEPN1結(jié)構(gòu)域向HEPN2結(jié)構(gòu)域移動，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位點，其隨后以非特異性方式裂解單鏈靶標(biāo)和旁系RNA。研究結(jié)果證實target RNA的結(jié)合導(dǎo)致LbuCas13a的兩個HEPN結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，從而激發(fā)LbuCas13a非特異性地切割任意單鏈RNA的酶切活性，該成果為研究Cas13a發(fā)揮RNA酶活性的分子機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。該研究的發(fā)現(xiàn)為CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的進(jìn)一步開發(fā)提供了可靠的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對深入理解細(xì)菌抵御病毒入侵的分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，并將對病毒引起的疾病的預(yù)防、檢測、控制與治療產(chǎn)生重大意義，特別是基于Cas13a高效的RNA酶切活性，對其應(yīng)用于各類重大疾病的快速檢測具有十分廣闊的前景。

 

開發(fā)DNA大片段編輯技術(shù)研究染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)
源于細(xì)菌和古菌的Ⅱ型成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9]近年被改造成為基因組定點編輯的新技術(shù)。由于它具有設(shè)計簡單、操作方便、費(fèi)用低廉等巨大優(yōu)勢，給遺傳操作領(lǐng)域帶來了一場革命性的改變�；�于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組DNA片段靶向編輯技術(shù)主要包括DNA片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)、插入和易位等，這一有效的DNA片段編輯方法為研究基因功能、調(diào)控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。我將著重匯報我們在該領(lǐng)域最新的研究CTCF等染色質(zhì)架構(gòu)蛋白在三維基因組組裝調(diào)控的進(jìn)展，為開展利用基因組DNA片段靶向編輯進(jìn)行基因調(diào)控和功能研究提供參考。

 

Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-Threatening Viruses as Precision Therapeutics
The conversion of life-threatening viruses into live but avirulent vaccines represents a revolution in vaccinology. In a proof-of-principle study, we expanded the genetic code of the genome of influenza A virus via a transgenic cell line containing orthogonal translation machinery. This generated premature termination codon (PTC)–harboring viruses that exerted full infectivity but were replication-incompetent in conventional cells. Genome-wide optimization of the sites for incorporation of multiple PTCs resulted in highly reproductive and genetically stable progeny viruses in transgenic cells. In mouse, ferret, and guinea pig models, vaccination with PTC viruses elicited robust humoral, mucosal, and T cell–mediated immunity against antigenically distinct influenza viruses and even neutralized existing infecting strains. The methods presented here may become a general approach for generating live virus vaccines that can be adapted to almost any virus.

 

建立高效的CRISPR/Cas9編輯技術(shù)
CRISPR/Cas9是一項革命性的基因編輯技術(shù)，得到廣泛應(yīng)用。我們從兩個方面著手提高CRISPR/Cas9的編輯效率。我們利用附著體載體表達(dá)Cas9和gRNA，稱之為epiCRISPR技術(shù)。附著體載體不整合到基因組，但是可以隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制，因而可以長期的表達(dá)外源基因，實現(xiàn)長期的基因編輯。同時在附著體載體上表達(dá)嘌呤霉素抗性基因，可以富集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。編輯完成后撤除篩選藥物，附著體質(zhì)粒迅速丟失，編輯后的細(xì)胞不再表達(dá)外源基因。利用附著體技術(shù)可以實現(xiàn)高達(dá)100%編輯效率，還可以高效的敲除基因組大片段，以及同時敲除多個基因。CRISPR/Cas9編輯效率受gRNA序列影響，不同的gRNA效率差別很大，測試gRNA效率費(fèi)時費(fèi)力。我們建立了高通量的測試gRNA活性的方法，得到了5萬多條gRNA的活性，覆蓋了2萬多個人類基因。這些工作將會極大的方便基因編輯工作。

 

利用靶向性胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行基因編輯
單核苷酸的多樣性是遺傳多樣性的主要來源，是人類個體差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)，同時也是分子進(jìn)化的動力和很多疾病的直接誘因。然而，在哺乳動物中，仍然缺乏有效誘導(dǎo)單核苷酸的突變的工具，無法通過實驗高效和高通量的地研究單核苷酸突變的功能�，F(xiàn)有的大部分實驗技術(shù)只能擾亂基因的功能或者表達(dá)，造成基因功能缺失，對誘導(dǎo)新功能的獲得無能為力。而利用靶向性胞嘧啶脫氨酶介導(dǎo)的堿基編輯（Targeted AID-mediated mutagenesis ,TAM）技術(shù)，可以在sgRNA靶向的基因組DNA上，將胞嘧啶和鳥嘌呤隨機(jī)地向其它三個堿基轉(zhuǎn)變，因而產(chǎn)生海量的突變體，結(jié)合遺傳篩選，從而分析單核苷酸突變的功能或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的體內(nèi)進(jìn)化。同時在一種多肽抑制劑（UGI）的輔助下，dCas9-AID可以誘導(dǎo)特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)單堿基的精確編輯，為治療單核苷酸突變誘導(dǎo)的遺傳病提供方案。利用這項技術(shù)，已經(jīng)在慢性骨髓瘤細(xì)胞中，成功篩選出已報道的以及新的imatinib耐藥性位點。因此，作為高效的哺乳動物DNA堿基編輯新技術(shù)，TAM可以廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程，分子遺傳學(xué)研究和基因治療等領(lǐng)域。

 

基因治療已經(jīng)在多種人類疾病治療中顯示出巨大的潛能。然而目前的方法通常只針對單個基因或單個突變，使得對多基因或多點突變的疾病治療受到極大限制。視網(wǎng)膜色素變性是臨床常見的致盲眼病，極具臨床和遺傳異質(zhì)性，是導(dǎo)致人類視力障礙最主要的疾病之一。目前已有超過40個基因和位點被報道與視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)。這里我們采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯方法，對視網(wǎng)膜色素變性小鼠進(jìn)行了基因治療。通過突變視桿細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrl或Nr2e3，將視桿細(xì)胞重編程為視錐細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的視錐樣細(xì)胞對突變引起的感光細(xì)胞退化不敏感，從而使小鼠在發(fā)病后期仍能保留一定程度的視力。我們的發(fā)現(xiàn)不僅為視網(wǎng)膜色素變性提供了新的不依賴于基因突變的治療方法，而且證明了基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的細(xì)胞重編程、細(xì)胞退化預(yù)防以及組織功能保護(hù)的巨大可能性。

 

基因修飾動物是研究在發(fā)育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效的應(yīng)用于構(gòu)建基因敲除和敲入小鼠。然而，該方法獲得的基因修飾動物存在嚴(yán)重的嵌合體現(xiàn)象，即動物個體的一部分細(xì)胞被基因編輯，而另一部分則沒有。通過交配方法獲得純合的基因敲除小鼠需要很長的時間和花費(fèi)，這在獲得多基因敲除小鼠中尤為明顯。而由于猴子的生殖周期長（4-5年性成熟，半年懷孕期），生殖能力低（單胎動物），通過交配方法來獲得純合突變的基因修飾猴則需要更長的時間和花費(fèi)。為此，我們通過優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功的在第一代就獲得了單基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴，可以直接用于表型分析，極大促進(jìn)了非人靈長類動物模型的建立及其在腦科學(xué)及腦疾病中的研究。同時我們設(shè)計了一種同源介導(dǎo)末端接合（HMEJ）策略，可以在分裂和非分裂細(xì)胞中均實現(xiàn)精確且高效的基因整合。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎或者體內(nèi)的肝細(xì)胞和神經(jīng)元中，該方法的效率均遠(yuǎn)高于以HR、NHEJ和MMEJ為基礎(chǔ)的策略。因此，這種HMEJ策略可能具有多種運(yùn)用性，譬如基因編輯來獲得動物模型以及靶向基因治療。
通過上述幾種方法，我們可以有效的在猴中獲得各種基因修飾猴模型。近期，我們目標(biāo)獲得的疾病猴模型包括PD，AD，ALS，DMD，RP，AS等，工具猴模型包括光遺傳猴，各種神經(jīng)元特異的Cre猴等。這些猴模型的建立將極大促進(jìn)我們對人類疾病的了解和治愈。
此外，我們也致力于各種CRISPR相關(guān)工具的開發(fā)及優(yōu)化，包括CRISPR激活系統(tǒng)，CRISPR標(biāo)記系統(tǒng)，CRISPR介導(dǎo)的成體治療等等。

 

基因編輯技術(shù)通過插入、缺失或替換的手段對基因組進(jìn)行定點改造，既能夠通過以突變基因代替正�；�因來研究基因的功能，也能夠以正常基因代替突變基因來進(jìn)行基因治療。近年來，有著“基因剪刀”之稱的CRISPR/Cas9技術(shù)被認(rèn)為是能夠在活細(xì)胞中快速、準(zhǔn)確地編輯目的基因的有效方法。隨著人類在破譯基因的遺傳密碼和基因編輯技術(shù)上的不斷突破，通過修改基因從根本上治愈和預(yù)防疾病成為可能，特別是在單基因疾病的治療上，基因編輯有著廣闊的運(yùn)用前景。就生殖健康方面而言，卵巢早衰這類由表觀遺傳引起的疾病目前只能通過替代治療延緩癥狀，不能根治。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)有望對表觀遺傳的靶點進(jìn)行遺傳編輯，改善生殖健康，也為生殖相關(guān)疾病提供了新的治療思路。此外，利用基因編輯對胚胎特定基因集進(jìn)行敲除操作，造成相應(yīng)基因在胚胎中的缺失，可深入研究人類胚胎早期發(fā)育中的功能、作用機(jī)理，幫助人類了解生物體的基本功能，也可以推動人類健康事業(yè)的發(fā)展,從根源上清除遺傳疾病。

 

在豬PK15細(xì)胞系中，證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬細(xì)胞系中能高效地誘導(dǎo)豬基因敲除。設(shè)計和構(gòu)建了豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9文庫，該文庫包含了65316個gRNAs、覆蓋了13229個基因，其中含有5個gRNAs的基因有11400個基因、含有4個gRNAs的基因有1829個，并且全部的基因都含有至少2個gRNAs（最多不超過5個gRNAs/基因）。利用該豬全基因組基因突變gRNAs文庫進(jìn)行大規(guī)模的基因篩選，初步篩選出了140個候選宿主基因，并證實了其中的32個候選基因在病毒復(fù)制增殖中具有一定的調(diào)控作用

 

利用dcas9和超高靈敏度蛋白質(zhì)譜平臺構(gòu)建位點特異DNA-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)
隨著功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，對調(diào)控基因表達(dá)的順式（cis-）和反式(trans-)作用元件進(jìn)行系統(tǒng)研究成為當(dāng)前急需填補(bǔ)的領(lǐng)域空白。利用生物素化的（biotinylated）功能缺失的dcas9系統(tǒng)加上能與我們所感興趣位點能夠形成特定結(jié)合的SgRNA，在原位去分離純化我們感興趣位點DNA以及與這個位點有特定結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。我們利用該系統(tǒng)去研究在白血病細(xì)胞系K562中，與血紅蛋白（Hemoglobin）的幾個亞型HBB、HBG、HBE1、以及與調(diào)控相關(guān)的幾個重要的增強(qiáng)子HS1、HS2、HS3、HS4和HS5 上面所結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在該實驗中，我們利用Streptavidin的免疫特異性樹脂球?qū)�帶有Biotin基團(tuán)的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行純化。然后進(jìn)行了iTRAQ的標(biāo)記，最后，樣品由高靈敏度的全蛋白定量平臺進(jìn)行定量的分析。在該實驗中，我們能夠檢測到如GATA1，TAL1，NFE2等與血紅蛋白的表達(dá)息息相關(guān)的已知的轉(zhuǎn)錄因子。與此同時，我們也能發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)核孔蛋白NUP98以及NUP153結(jié)合在hemoglobin基因的位點上面。然后，我們利用該方法研究了跟疾病關(guān)系密切的位點，HBE1到HBD之間的區(qū)域。通過蛋白質(zhì)組學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)與HBD-1K相結(jié)合的蛋白質(zhì)的數(shù)量要多于與HBD-1.5K以及HBD-2K的蛋白我們同時也測定了與這些位點有相互作用的DNA區(qū)域，我們也同樣發(fā)現(xiàn)與HBD-1K相結(jié)合的DNA的數(shù)量要多于與HBD-1.5K以及HBD-2K的DNA數(shù)量。綜合以上的證據(jù)，HBD-1K是一個重要的疾病相關(guān)基因，通過CRISPR技術(shù)敲除了HBD-1K之后，我們能夠發(fā)現(xiàn)HBG的基因轉(zhuǎn)錄受到了明顯的影響，而HBB的轉(zhuǎn)錄則大致不變。我們的技術(shù)表明了，我們能對特定的DNA區(qū)域，即使是對單拷貝的DNA位點能夠進(jìn)行全面深度的蛋白質(zhì)復(fù)合物的解析。這些解析的結(jié)果能夠幫助我們發(fā)現(xiàn)那些對特定基因起著重要調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，對研究這些基因的激活與靜默機(jī)制有著至關(guān)重要的作用。

 

更多精彩，期待現(xiàn)場                                              

 

時間：2018年3月30-日~3月31日   

地點：北京維也納國際酒店(北京廣安門店)  北京 西城區(qū) 白廣路7號

主辦單位：北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室  

大會主席：周德敏教授

會議官網(wǎng)：http://www.acadeevent.com/geneediting/index.html

 

 

張依寒    

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