賽多利斯推出新品:2000L連續(xù)細胞培養(yǎng)操作系統(tǒng)

 

在生物制藥行業(yè)，連續(xù)制造通常被認為是提高生物生產(chǎn)效率的方法。與批處理相比，它可以在更小的設(shè)備內(nèi)生產(chǎn)更多的產(chǎn)品，同時提高產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是對敏感和不穩(wěn)定的分子。對上游和下游操作進行連續(xù)方法的相關(guān)調(diào)查表明：為將連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)勢充分實現(xiàn)，即細胞培養(yǎng)、收獲和產(chǎn)品純化必須有效地集成。這是行業(yè)內(nèi)的趨勢：將包括生物生產(chǎn)和生物過程的平臺包括種子生物反應(yīng)器等過程視為一個整體，統(tǒng)籌處理。

細胞培養(yǎng)操作在確定整個生產(chǎn)過程中起著至關(guān)重要的作用。在過去幾十年中，該行業(yè)在從補料分批培養(yǎng)中獲得更高的產(chǎn)品效價方面取得了很大的進展。其中一個結(jié)果是向更小的生物反應(yīng)器邁進，用一次性技術(shù)取代舊的不銹鋼設(shè)備。一些公司選擇發(fā)展灌注過程。他們是尤其是在生產(chǎn)不穩(wěn)定，半衰期短的治療產(chǎn)品過程中，優(yōu)勢明顯。

在灌注控制下，蛋白質(zhì)可以不斷地從培養(yǎng)容器中提取并在降解前純化。營養(yǎng)物質(zhì)的不斷增加和有毒代謝物的去除，使灌注培養(yǎng)能夠在數(shù)周內(nèi)達到，并維持高的細胞密度。這不僅是一個高生產(chǎn)率的條件，而且還允許細胞保持在一個穩(wěn)定的狀態(tài)，并表達一致性的產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)基質(zhì)量的發(fā)展以及細胞過濾器強度的增加都為細胞連續(xù)培養(yǎng)起到了推動作用。

然而，該技術(shù)仍然存在一些缺點，包括長時間操作細胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)：例如，防止污染和在收獲和純化多批次過程中一致性的驗證。這些問題在新藥研發(fā)過程中尤為重要。因此，一些公司決定在采用灌注模式，通過保留新的培養(yǎng)基和通過超濾裝置去除被耗盡的培養(yǎng)基，從而收集產(chǎn)物（有時稱為濃縮進料批處理模式）�？梢赃_到和維持非常高的細胞密度，在短時間內(nèi)提供很高的生產(chǎn)率，而不需要額外地對多個“子批次”進行收集和純化。

然而，連續(xù)上游操作的全部潛力尚未全部挖掘。新技術(shù)的運用，將臨床前，臨床，商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的效率得到很大提高。由于可以達到如此高的滴度，一些熱銷的藥物也會采用2000L一次性生物反應(yīng)器進行生產(chǎn)。這樣操作的優(yōu)點就是省略了一個額外的放大步驟，并以此消除與時間和進一步調(diào)節(jié)過程中所產(chǎn)生的風險。此外，藥物制造商可以利用灌注操作中，可以充分利用一次性反應(yīng)器的所有優(yōu)點。

 

生物反應(yīng)器接種和初始批處理階段后，使用細胞截留裝置，以恒定的收獲流速去除無細胞上清液。同時，等量補充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過稱重傳感器接收信號的飼料泵或一個平臺平衡來實現(xiàn)培養(yǎng)基添加的控制，這樣操作員就可以保持一個確定的生物反應(yīng)器重量。多種方法可以使用，包括基于營養(yǎng)水平來調(diào)整日常培養(yǎng)基添加量。

隨著細胞密度的增加，營養(yǎng)消耗和代謝物的積累，需要提高新鮮培養(yǎng)基的交換率，或者，也就是每天遵循一個預(yù)設(shè)定程序進行培養(yǎng)基交換。在線生物量測量，提供了一種基于細胞密度信號，從而控制灌注或細胞濾出率的自動選擇方法。使用在線葡萄糖和乳酸測量的生物反應(yīng)器中，操作員通過添加濃縮飼料可以控制葡萄糖濃度。圖1中的示意圖顯示了一個典型的集中灌注或分批設(shè)置。

典型的灌注率下降到每天一至兩反應(yīng)器體積的范圍。采用較低的細胞濾出速度可以建立恒定的細胞生長速率，并且可以維持高的存活率，進而最大限度避免細胞截留裝置的堵塞。根據(jù)細胞截留膜的孔徑大小或截留率，蛋白質(zhì)產(chǎn)物將存在于在無細胞上清液（微濾灌注）中或保留在生物反應(yīng)器中（超濾灌注）。由于大多數(shù)抗體是相對穩(wěn)定的，所以在生物反應(yīng)器中直接灌注的策略，為這種產(chǎn)物的積累提供了一種簡單而直接的方法，增加給定抗體制造設(shè)施的空間/時間產(chǎn)量。對于易降解的重組蛋白，微濾灌注是一種較好的選擇。那些可能表現(xiàn)出反饋抑制作用的產(chǎn)物，應(yīng)盡可能快地從細胞培養(yǎng)中分離出來，然后在隨后的純化過程中轉(zhuǎn)移到冷卻的收獲罐中。使用賽多利斯一次性攪拌槽生物反應(yīng)器（聯(lián)合多種尺寸的細胞截留裝置），可以在2L體積水平進行灌注。例如，一個公司可以使用德國貝朗或b-dcu控制器，隨后規(guī)模擴大過程至500L，1000L水平時，BIOSTAT STR系統(tǒng)。在1000升和2000-L水平，細胞截留裝置（例如，Repligen的ATF系統(tǒng)過濾模塊）通過一個使用生物反應(yīng)器包有二合一側(cè)端口。通過生物反應(yīng)器的外部環(huán)無菌連接器進行操作。

另外，Spectrum Labs和其他公司建議一次性反應(yīng)器使用中空纖維模塊，在切向流模式下保持細胞截留。也可以使用連續(xù)離心的方式對細胞進行截留。連續(xù)離心的優(yōu)點是，它避免了過濾器堵塞，并允許死細胞選擇性地分離和去除。

對于所有這些選擇，至關(guān)重要的是，保證外部循環(huán)盡可能短，以避免細胞培養(yǎng)物暴露于不受控制的環(huán)境條件，最關(guān)鍵的是那些與溫度和溶解氧有關(guān)的（DO）因素。

 

灌注成功的關(guān)鍵是高效的鼓風系統(tǒng)，這樣可以為細胞培養(yǎng)提供充足的氧氣。在增強的培養(yǎng)過程中，會形成大量的二氧化碳，必須去除，以防止抑制產(chǎn)物形成的或?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生的潛在的負面影響。在BIOSTAT STR一次性生物反應(yīng)器中，許多微型噴頭構(gòu)成一個大型噴霧器，通過150微米孔，壓縮空氣并對其進行凈化。這種一次性噴射器的模塊已在傳統(tǒng)的不銹鋼反應(yīng)器應(yīng)用多年。

一個不可忽視的問題是，由于高速氣體流量和濃縮細胞培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量，會導致廢氣排放過程中形成過多的氣溶膠。一個專門開發(fā)的基于板式換熱器原理設(shè)計的一次性排氣冷凝器，可以減少堵塞過濾器的風險，并大大提高可靠性。賽多利斯生物反應(yīng)器額外的安全聯(lián)鎖控制軟件會防止因堵塞的細胞截留裝置而導致細胞溢出。此外，所有進料泵和氣流如果超過其最大工作壓力，則將會中斷進料。

接下來，我們將討論兩種不同的一次性2000L單抗生產(chǎn)生物反應(yīng)器。

 

美國一家大型生物技術(shù)公司評估了新系統(tǒng)在現(xiàn)有的一次性和不銹鋼生物反應(yīng)器在兩個灌注過程中的性能。這兩個過程都使用了一個普通的細胞截留裝置和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系產(chǎn)生兩種不同的單克隆抗體。2000L是最大的反應(yīng)器。三葉片段葉輪低剪切力攪拌用于均勻混合。150um孔徑噴頭保證氧氣交換率在<40h-1。經(jīng)典的攪拌槽的設(shè)計保證了其使用符合單位體積內(nèi)功率輸入和葉尖速度等標準。幾何設(shè)計的相似性，保證了賽多利斯反應(yīng)器能從250ml無縫放大到2000L。

BIOSTAT STR生物反應(yīng)器的袋子是用新S80多層聚乙烯薄膜。生物合成也可以用該種薄膜，其將來也可用于儲存，凍融等方面。這將為公司減少開支，無需購買其他材料。在細胞培養(yǎng)中，S80薄膜提供可再生的細胞生長可以媲美的硼硅酸鹽玻璃。這種生物反應(yīng)器（包括耗材）已在1000升的規(guī)模使用CHO分批單克隆抗體的生產(chǎn)過程得到證實。

為了對該系統(tǒng)進行基準測試，并證明其與現(xiàn)有的一次性使用生物反應(yīng)器功能的等價性，該公司使用連續(xù)細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)單克隆抗體A。這是一個比生產(chǎn)單克隆抗體A更苛刻的過程，因為它產(chǎn)生更高的細胞密度，需要更多的氧氣。這種情況對一次性生物反應(yīng)器來說是很有挑戰(zhàn)性的，因為這些生物反應(yīng)器通常不能用來處理如劇烈的排氣過程。 

 

單克隆抗體-生物反應(yīng)器的功能等價性的標桿：圖2顯示的是可行Biostat STR 2000 system的細胞密度（VCD）和細胞存活率（%）與現(xiàn)有的一次性生物反應(yīng)器的歷史數(shù)據(jù)比較。前者的平均數(shù)據(jù)屬于這些歷史數(shù)據(jù)產(chǎn)生的平均值正負一個標準差范圍內(nèi)。

圖3（top）比較來自兩個生物反應(yīng)器的填充細胞體積數(shù)據(jù)（%）。結(jié)果表明，這兩個系統(tǒng)具有高度的相似性。圖3（bottom）packed-cell adjusted product titers顯示兩個系統(tǒng)也有很高相似性。從這些結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，新系統(tǒng)在功能上等同于現(xiàn)有的2000-L一次性使用生物反應(yīng)器。與歷史數(shù)據(jù)相比，維持新系統(tǒng)培養(yǎng)點所需的氧氣較少，這表明氧傳遞能力更好。

單抗B生產(chǎn)：對BIOSTAT STR進行一個更具挑戰(zhàn)性檢測： 兩種單抗B生產(chǎn)均在過BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)中完成。其中一個過程比另外一個的運行時長多25%。對于較短的過程，VCD和百分之活率與現(xiàn)有的一次性使用生物反應(yīng)器的歷史數(shù)據(jù)相比較（圖4）。

Packed-cell adjusted product titer數(shù)據(jù)顯示兩者也有著很高的相似度。但是在該過程中，兩種生物反應(yīng)器存在一個明顯的差異：在新系統(tǒng)中總的氣體流量和氣裹壓力壓力通常比其他一次性使用的生物反應(yīng)器低。顯然，前者的氧傳遞效率更高。其較低的氣體流量可減少氣泡破裂引起的剪切損傷，降低因泡沫堵塞排氣過濾器的風險。這種新的生物反應(yīng)器大的頂部空間可以進一步減輕這種風險。圖5說明了兩種單用生物反應(yīng)器在通氣性能上的差異。上述結(jié)果表明： MAb B可以用BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)進行一個較長時間的生產(chǎn)。

整體上來看，因為一次性生物反應(yīng)器的氧傳遞受到限制，只有在不銹鋼生物反應(yīng)器中才有可能。

第二組培養(yǎng)過程在BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)（具有較長的不銹鋼反應(yīng)器）中進行。圖6和圖7顯示了兩者的一致性。一次性生物反應(yīng)器提供的較低的總氣體流量足以支持細胞生長和產(chǎn)物形成，顯示了系統(tǒng)的優(yōu)越氧傳遞。圖6還顯示了一次性系統(tǒng)在兩種不同攪拌速率下的性能。顯然，氧傳遞速率不一致性是該生物反應(yīng)器的限制參數(shù)，如果能解決這個問題，則打開了更長的過程、更高的細胞密度和更高的生產(chǎn)率的大門。

我們已經(jīng)證明，BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)在連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體方面，能夠提供，現(xiàn)有的一次性生物反應(yīng)器相當?shù)男阅�。由于其�?yōu)越的氧轉(zhuǎn)移率，所以發(fā)酵過程中只需要更少的氣體。這樣就降低了生物反應(yīng)器中過多的泡沫和壓力積聚造成排氣過濾器堵塞的風險。生產(chǎn)第二種抗的過程中其要求更高，憑借其優(yōu)越的氧轉(zhuǎn)移效率，使培養(yǎng)物比其他一次性生物反應(yīng)器運行更長的時間。新系統(tǒng)的工藝性能與不銹鋼系統(tǒng)相媲美。所以BIOSTAT STR2000系統(tǒng)，生產(chǎn)單個單抗時，可以以更高的細胞密度，生產(chǎn)更多的單抗產(chǎn)品，可以的連續(xù)運行的同時保留了一次性處理所有的優(yōu)點。

新興技術(shù)應(yīng)用于細胞培養(yǎng)過程的開發(fā)、規(guī)模化和過程控制。一旦這些應(yīng)用與高性能、單用途的生物反應(yīng)器相結(jié)合，那么極高的細胞密度培養(yǎng)就成為了現(xiàn)實。關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制需要先進的過程控制軟件和適當?shù)倪^程分析程序。氧和二氧化碳傳感器可安裝與生物反應(yīng)器排氣線路，以監(jiān)測和提供額外的觀察細胞培養(yǎng)代謝。在連續(xù)細胞培養(yǎng)過程中，可以使用營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物如葡萄糖和乳酸的測量值來提供營養(yǎng)供應(yīng)和培養(yǎng)的一般代謝狀態(tài)的信息。這些信息可以幫助公司使用全自動控制回路確定最合適的營養(yǎng)供給率。

自動化可行的生物測量完全可以集成到一次性生物反應(yīng)器中，以提供獨立的生物觀測信息。線測量減少了手工取樣的必要。通過將這種傳感器安裝在生物反應(yīng)器控制系統(tǒng)中，使在連續(xù)培養(yǎng)過程中自動監(jiān)測和控制成為可能。

生物反應(yīng)器和細胞培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，使細胞密度得到提高和保持。生物制藥公司是否選擇分批補料工藝或開發(fā)連續(xù)細胞培養(yǎng)方法將取決于它們各自的情況。技術(shù)創(chuàng)新將使他們能夠加快臨床試驗的速度，并在預(yù)定的設(shè)計空間內(nèi)開發(fā)出高滴度的抗體。

 

 

參考來源：

Continuous Cell Culture Operation at 2,000-L Scale by Christel Fenge, Nick Hutchinson, Michael Sherman, Vincent Lam and Melissa Carpio

 

賽多利斯斯泰帝(Sartorius Stedim Biotech)是國際領(lǐng)先的生物制藥行業(yè)設(shè)備和服務(wù)的供應(yīng)商，為全球生物制藥的開發(fā)與生產(chǎn)提供安全、及時、經(jīng)濟的一體化解決方案。作為完整解決方案的供應(yīng)商，賽多利斯斯泰帝提供幾乎涵蓋生物制藥工藝所有步驟的產(chǎn)品組合。公司致力于推廣一次性使用技術(shù)和增值服務(wù)，滿足生物制藥行業(yè)快速發(fā)展的技術(shù)需求。公司總部位于法國歐巴涅，在巴黎的歐洲交易所上市；因其位于歐洲、北美和亞洲的生產(chǎn)與研發(fā)中心以及遍布全球的銷售網(wǎng)絡(luò)而享譽世界。

 

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