與客戶共成就-THUNDER 助力用戶在《Cell》發(fā)表文獻

一支由耶魯大學YSM、哈佛醫(yī)學院BWH、蘇黎世大學IMCR和烏得勒支大學的科學家組成的國際團隊共同合作，發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18介導粘膜免疫屏障。2020年1月9日，國際學術期刊《Cell》在線發(fā)表了這一成果^[1]。在此篇文獻研究中，使用了THUNDER Imager 3D live cell高分辨寬場系統(tǒng)。

《Cell》是與《Science》、《Nature》齊名的重要國際性刊物�！禖ell》也是細胞生物學的最高期刊。2019最新的影響因子（Impact Factor）是 36.216。

腸道神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system， ENS）廣泛分布于腸道組織的每個角落，最新涌現(xiàn)的多個研究報道發(fā)現(xiàn)ENS可以調(diào)控腸道組織的免疫作用^[2]。但是ENS怎么參與粘膜免疫的呢，媒介是什么，作用機制又是怎樣的此前還未有研究成果。如今，以耶魯大學醫(yī)學院Richard A. Flavell和哈佛醫(yī)學院布萊根婦女醫(yī)院Roni Nowarski為首的這支國際團隊，研究并揭示了腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)如何參與維持腸粘膜免疫屏障。在沙門氏菌等致病菌的侵襲過程中，宿主細菌在腸道內(nèi)的防御是由ENS介導的。此研究使用了THUNDER系統(tǒng)進行smFISH成像，統(tǒng)計了特定ENS細胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗證了IL18廣泛在小鼠結腸組織ENS中有表達^[1]。

此表明，THUNDER 不僅僅提供清晰銳利的圖像，統(tǒng)計意義上的量化分析結果也獲得了國際權威期刊的認可。
  文獻賞析：
Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity
（腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18參與粘膜免疫屏障）
文章簡介：
粘膜免疫屏障是維持共生菌群和抵抗侵襲性細菌感染的必要條件。雖然過去普遍認為協(xié)調(diào)維護這種腸道穩(wěn)態(tài)的是免疫細胞和上皮細胞，但在這篇新發(fā)表的文章中，作者證明腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)在其中也扮演著重要的角色。ENS產(chǎn)生的促炎細胞因子IL-18能誘導腸上皮細胞產(chǎn)生抗菌蛋白（AMP），抵抗腸道感染。
通過共聚焦顯微鏡單細胞成像和THUNDER的smFISH組織成像的結合，作者觀察到腸神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生促炎細胞因子IL-18。值得注意的是，僅僅在腸神經(jīng)元中特異性敲除IL-18，可加劇小鼠的鼠傷寒沙門氏菌(S.t.)感染。說明源于腸神經(jīng)的IL-18對于抵抗腸道細菌感染是必須的；而特異性敲除免疫細胞或腸上皮細胞中的IL-18，不會影響小鼠對S.t.腸道感染的易感性。文章再結合單細胞轉錄組技術來探究ENS來源IL-18的功能以及作用方式。最終發(fā)現(xiàn)ENS特異性來源的IL-18能誘導結腸杯狀細胞增加表達抗菌蛋白AMP，從而抵抗致病菌的侵襲。說明腸神經(jīng)系統(tǒng)是抵御腸道致病菌的重要免疫介質。

以下就是文中使用THUNDER Imager 3D live cell成像的smFISH圖像，驗證了腸神經(jīng)系統(tǒng)ENS中的確廣泛存在IL18的表達。
  圖2E用smFISH檢測小鼠結腸組織中IL18 (紅色)、Tubb3(白色) 的表達；DAPI(藍色)表示細胞核。此圖可觀察到IL18 mRNA探針(紅色)與神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針(白色)的共定位。

實驗方法：處死小鼠，取出結腸，用冷PBS沖洗。結腸組織縱向切開，鋪于濾紙上。用4% 多聚甲醛PBS溶液固定3 h；隨后用30% sucrose, 4% PFA PBS溶液4度過夜孵育。切成7mm厚度切片，并使用smFISH染色。設計的FISH探針庫與Cy5 (IL18)、TMR (Tubb3)連接，smFISH探針集雜交(Moor et al.,2018)。封片前再去除ENS內(nèi)的自發(fā)熒光信號。smFISH成像是在Leica THUNDER 3D Live Cell系統(tǒng)上進行的，使用自帶的THUNDER Computational Clearing設置。

原文結論：在小鼠中使用Il18 mRNA探針進行單分子熒光原位mRNA雜交（smFISH）。作者使用來自Il18 -/-小鼠的結腸切片驗證了他們的Il18 mRNA探針的特異性。并觀察到Il18 mRNA探針和神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針有共定位（圖2E）。總之，這些數(shù)據(jù)表明腸神經(jīng)系統(tǒng)是結腸中IL-18的新型生產(chǎn)者。
  關于單分子熒光原位雜交(smFISH)技術：
全稱single-molecule fluorescence in situ mRNA hybridization (smFISH)，是研究單細胞基因表達能力的一種新的強有力的技術, 因為它能夠檢測和計數(shù)單個 RNA 分子。與深度測序方法互補, smFISH 提供了有關轉錄豐度的細胞間變異和特定 RNA 亞單位定位的信息。^[3][4]

另外有smFISH相關文獻表示，為了收集smFISH探針發(fā)出的最大數(shù)量的光子，更建議使用寬場技術。共焦顯微鏡會顯著限制要收集的光的數(shù)量^[5]，而寬場技術會是對smFIGH成像更好的選擇。
當然，這篇發(fā)表在《CELL》的文獻內(nèi)也大量使用了共聚焦技術對大鼠結腸神經(jīng)元進行單個細胞的免疫熒光成像。

綜上所述，此文章很好地結合了共聚焦成像和高分辨寬場技術。采用THUNDER高分辨寬場技術對smFISH探針進行快速大面積結腸組織成像，在RNA角度檢測到IL18 與Tubb3 的共表達，驗證了有IL18在小鼠結腸組織ENS的普遍的總體表達；再結合了共聚焦技術對大及小鼠結腸組織分離的肌間神經(jīng)叢的高倍成像，在蛋白的角度觀察到IL-18和Tubb3共同表達在單個神經(jīng)元細胞內(nèi)。最后兩種方法互相印證，得出了腸道神經(jīng)系統(tǒng)ENS能產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-18的結論。

這也是首次揭示了ENS能夠產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-18，抵抗致病菌的侵襲，維持腸黏膜免疫屏障。

THUNDER高分辨率快速的特點很好地滿足了小鼠結腸組織切片smFISH快速大視野掃描。不僅僅提供清晰銳利的圖像，由于成像速度快，能對組織進行大面積高清掃描，故此能用于后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。文章以THUNDER的smFISH成像為基礎，特定統(tǒng)計了ENS細胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗證了IL18廣泛在小鼠結腸組織ENS中有表達。

再加上此前的以下兩篇文章，THUNDER累計文章已達到三篇了。 2019-Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled

2019年8月發(fā)表于《Journal of Nuclear Medicine》，IF 7.354，使用THUNDER Imager 3D Tissue型號。^[6]
  Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish

2019年11月發(fā)表于《Developmental Biology》，IF 2.936，使用THUNDER Model Organism型號。^[7]


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參考文獻：
[1] Jarret A., Jackson R., Duizer C., Healy E.M.,Zhao J., Rone J. M.,Bielecki P., Sefik E.,Roulis M.,Rice T., Sivanathan  K.N.,Zhou T., Solis A.G.,Honcharova-Biletska H.,Ve´ lez E.,Hartner S.,Low J.,Qu R., Zoete M.R., Palm N.W., Ring A.M., Weber A.,Moor A.E.,Kluger Y.,Nowarski R., Flavell R.A. ,Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity, Cell 180, 50–63(2020).
 
[2]. Lai, N.Y., Musser, M.A., Pinho-Ribeiro, F.A., Baral, P., Ma, P., Potts, D.E., Chen, Z., Paik, D., Soualhi, S., Shi, H., et al. (2019).
 
[3] Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, (10), 877-879 (2008).

[4] Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).

[5] Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).

[6] Zohreh V., Sarajo M.,3, Stephanie R., Miriam B., Yuanfang L., Negar O., Geoffrey T., Ting S., Stephan G. N., Antonia R., Christian W., Andreas H., Uwe A. H., Wolfgang A. W., Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled fibroblast activation protein inhibitor FAPI-04, J Nucl Med.,10.2967, (2019).
 
[7] Grimes, D.T., Patterson, V.L., Luna-Arvizu, G., Schottenfeld-Roames, J., Irons, Z.H., Burdine, R.D., Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish, Developmental Biology (2019)