STELLARIS首秀-多重拍攝解鎖SARS-CoV-2致病機(jī)制

研究概覽

SARS-CoV-2（嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2, 又稱新型冠狀病毒或COVID-19）病毒的“爆發(fā)”無疑是2020年的頭號國際公共衛(wèi)生緊急事件。研究表明，SARS-CoV-2病毒比2002/03年的非典病毒（SARS-CoV-1）具有更高的有效傳播率，對人類健康構(gòu)成了重大威脅^[2]。SARS-CoV-2感染早期階段上呼吸道上皮細(xì)胞中病毒的活躍復(fù)制是導(dǎo)致其高傳播率的主要原因之一^[3]。對SARS-CoV-2患者的尸檢結(jié)果顯示，病毒主要在上下呼吸道上皮和肺泡中復(fù)制^[4] 。

目前，我們對SARS-CoV-2感染影響上皮細(xì)胞功能的機(jī)制知之甚少。為了揭示SARS-CoV-2從上呼吸道向肺深部擴(kuò)散的致病機(jī)制，作者在人支氣管上皮體外重建模型中研究了SARS-CoV-2與其主要靶細(xì)胞的相互作用方式，分析了SARS-CoV-2感染引起細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和功能變化。研究結(jié)果表明SARS-CoV-2感染早期會引發(fā)氣道上皮結(jié)構(gòu)中纖毛層（Ciliary layer）的破壞，致使纖毛運動能力減弱，導(dǎo)致黏膜纖毛（Mucociliary）局部清除障礙。局部纖毛的損傷可減緩病毒向咽部的運輸，增加其進(jìn)入支氣管系統(tǒng)更深區(qū)域的幾率，直到進(jìn)一步感染肺泡并引發(fā)肺細(xì)胞的損傷。
 

呼吸道上皮

研究過程

研究圍繞SARS-CoV-2對呼吸道上皮的感染過程展開。作者選用人的呼吸道上皮體外重建模型（MucilAir™模型，EPITHELIX公司）進(jìn)行研究（圖2A）。支氣管上皮細(xì)胞在空氣/液體界面（ALI）分化了4周后，作者通過掃描電鏡確定了模型中支氣管上皮細(xì)胞分化為假復(fù)層上皮，包括杯狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和基底細(xì)胞三種主要的細(xì)胞類型（圖2B）。隨后，作者用SARS-CoV-2病毒懸液（106pfu/mL）感染重建的上皮組織4小時并監(jiān)控病毒RNA、TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）、細(xì)胞緊密連接、TEER（跨上皮電阻）等指標(biāo)，最終確認(rèn)從病毒感染到組織損傷后部分恢復(fù)病毒清除能力的時間窗口為7天（詳細(xì)結(jié)果見論文原稿）。

隨后，該STELLARIS出場了，作者檢測病毒感染的主要細(xì)胞為β-tubulin陽性的纖毛細(xì)胞（圖3A）。利用共聚焦顯微鏡對假復(fù)層上皮的縱向掃描結(jié)果顯示SARS-CoV-2對纖毛上皮細(xì)胞有優(yōu)先的趨向性（圖3B）。隨后的電鏡結(jié)果也顯示SARS-CoV-2病毒對纖毛層有很強(qiáng)的破環(huán)作用（圖3E、F）。

為了進(jìn)一步確認(rèn)SARS-CoV-2病毒破壞纖毛的機(jī)制，作者通過共聚焦進(jìn)行了感染前后纖毛微管遠(yuǎn)端/近端峰值比率的測定（圖4A、B）。結(jié)果顯示，SARS-CoV-2病毒感染兩天后纖毛通常呈現(xiàn)出縮短和畸形，其微管信號的遠(yuǎn)端/近端峰值比顯著低于未感染的細(xì)胞。透射電鏡的結(jié)果顯示，SARS-CoV-2感染通過誘導(dǎo)軸突（Axoneme）的丟失和基底小體（Basal body）錯位破壞原有的纖毛結(jié)構(gòu)（圖4E-H）。

接下來，作者用時間序列拍攝檢測SARS-CoV-2感染對上皮體外重建模型微粒清除能力的影響（圖5A、B）。結(jié)果顯示，SARS-CoV-2感染不僅影響纖毛擺動的方向（圖5C、D）和速度（圖5E），還影響纖毛擺動的協(xié)調(diào)性（圖5F，徑直度）。換句話說，SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的纖毛損傷能顯著降低呼吸道上皮的黏膜纖毛清除能力。

最后，作者在體外（上皮重建模型）和體內(nèi)（金黃色敘利亞倉鼠模型）研究中對SARS-CoV-2感染后的呼吸道應(yīng)激修復(fù)能力進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，感染7天后上皮重建模型中基底細(xì)胞的密度增加，部分向纖毛細(xì)胞轉(zhuǎn)變（圖6A-C），培養(yǎng)體系內(nèi)IFN表達(dá)水平上升（結(jié)果見論文原稿）。說明SARS-CoV-2感染可觸發(fā)上皮防御和修復(fù)機(jī)制。在金黃色敘利亞倉鼠模型中，基底細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變則跟SARS-CoV-2感染時病毒的計量正相關(guān)（圖6E）。至此，作者根據(jù)研究得到的結(jié)論和已有研究成果推定：SARS-CoV-2感染后固有的上皮防御和修復(fù)機(jī)制可能發(fā)生得太晚，來不及阻止病毒在呼吸樹（Respiratory tree）中的傳播和繼發(fā)性感染的發(fā)生。

下面我們來盤點一下研究過程中作者用到了STELLARIS的哪些技能：

雖然文中沒有用到，但不能不提STELLARIS的獨門“技能”——TauSence模塊^[6]。在徠卡多個專利技術(shù)的加持下，STELLARIS成功實現(xiàn)將熒光壽命維度引入共聚焦成像平臺。與傳統(tǒng)共聚焦相比，STELLARIS能幫助您多一個維度獲得樣品圖像、輕松避免串色、進(jìn)一步擴(kuò)展多色實驗設(shè)計（基于熒光壽命）、實現(xiàn)樣品組分拆分……優(yōu)點實在太多（詳細(xì)資料敬請回顧徠卡顯微系統(tǒng)公眾號往期文章）。

結(jié)語
應(yīng)用STELLARIS的研究論文秀才剛剛拉開帷幕，后面STELLARIS會為大家展示更加豐富的成像“技能”，幫助用戶“Get Closer to the Truth”！徠卡STELLARIS共聚焦顯鏡接下來還會繼續(xù)舉辦全國范圍內(nèi)的上市巡展，歡迎大家前來體驗STELLARIS的“十八般武藝”。