迷你大腦長眼睛——徠卡助力人腦類器官研究新突破

當(dāng)前，類器官研究如火如荼。這種在體外用3D培養(yǎng)技術(shù)對干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化形成的在結(jié)構(gòu)和功能上都類似目標(biāo)器官或組織的三維細(xì)胞復(fù)合體，包含多種細(xì)胞類型，突破了細(xì)胞間單純的物理接觸聯(lián)系，形成了更加緊密的細(xì)胞間生物通信，細(xì)胞間相互影響、誘導(dǎo)、反饋，協(xié)作發(fā)育并形成具有功能的迷你器官或組織，能更好地模擬器官組織的發(fā)生過程及生理病理狀態(tài)，因而在基礎(chǔ)研究以及臨床診療方面具有廣闊的應(yīng)用前景^[1][2]。由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)產(chǎn)生的3D人腦類器官為研究大腦發(fā)育、疾病等提供了巨大的機(jī)會，這種腦組織體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)是更好地理解發(fā)育性腦障礙發(fā)病機(jī)制的有力工具。由大腦類器官發(fā)育出各種不同的類腦區(qū)，組織形成離散區(qū)域，并能夠相互影響，從而幫助我們了解腦組織細(xì)胞的多樣性、復(fù)雜的相互作用和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)^[3]。
 
眼睛的發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，了解它可為早期視網(wǎng)膜疾病治療奠定基礎(chǔ)。其中，研究視神經(jīng)泡至關(guān)重要，因為視神經(jīng)泡是眼睛的原基，其近端連接到前腦，為眼睛正常形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而從多能細(xì)胞分化出來的離體視網(wǎng)膜類器官不能形成類似體內(nèi)的視神經(jīng)泡和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞層，這可能是因為離體視網(wǎng)膜類器官缺乏前腦（一種與視網(wǎng)膜發(fā)生發(fā)育相關(guān)的非視網(wǎng)膜類型組織^[4]）。
 
胚胎發(fā)育過程中，視泡由間腦通過器官發(fā)生多個階段發(fā)育而來（圖1A）。那么能否讓大腦類器官像人胚胎發(fā)育般，組裝產(chǎn)生兩側(cè)對稱的視神經(jīng)泡成為巨大挑戰(zhàn)。利用iPSCs衍生的人腦類器官能否打破這個障礙？近期，杜塞爾多夫海因里希·海涅大學(xué)Jay Gopalakrishnan等人發(fā)表在 Cell Stem Cell上的一篇研究報道^[5]，成功讓夢想照進(jìn)現(xiàn)實。
 
快來看看作者是如何設(shè)計實驗并借助哪些神器最終實現(xiàn)“迷你大腦長眼睛了……”
 
   作者首先修改了多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方案。從使用低密度的細(xì)胞數(shù)開始，并在神經(jīng)外胚層擴(kuò)張期加入0-120nM醋酸視黃醇。添加60nM的醋酸視黃醇可重復(fù)在第30天左右誘導(dǎo)產(chǎn)生色素結(jié)構(gòu)（pigmented structures），并分布于大腦類器官的一極(圖1B)。作者繼續(xù)通過免疫熒光染色及使用徠卡共聚焦SP8多色熒光成像，研究色素結(jié)構(gòu)區(qū)域的眼睛相關(guān)生物標(biāo)志物。共聚焦圖像顯示該區(qū)域的RAX, Pax6和FOXG1免疫熒光信號呈陽性(圖1C-D)。還觀察到突出的SOX2陽性內(nèi)陷區(qū)，顯示VSX2和FOXG1梯度表達(dá)，表明類器官的視覺區(qū)域與前腦區(qū)分離(圖1E-G)。并結(jié)合單細(xì)胞測序來進(jìn)行細(xì)胞多樣性的研究。
  持續(xù)培養(yǎng)類器官，色素區(qū)域在50 ~ 60天內(nèi)逐漸發(fā)育形成1 ~ 2個深色的視神經(jīng)囊泡樣結(jié)構(gòu)，作者稱這些器官為視泡腦類器官(OVB-organoids)。通過單細(xì)胞測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)比對及免疫熒光染色、徠卡共聚焦顯微成像雙重驗證。發(fā)現(xiàn)OTX2陽性核在RPE細(xì)胞附近形成一層狀結(jié)構(gòu)，在更深的組織中也呈梯度表達(dá)。在一些情況下，OTX2陽性的細(xì)胞核，ONECUT2信號呈陽性，BRN3也呈陽性并顯示出RGCs的層狀結(jié)構(gòu)(圖2A-B-C)。并隨后分析了早期視網(wǎng)膜發(fā)生的確定生物標(biāo)志物，包括VSX2(神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞)、Recoverin、CRX和NRL，并以視網(wǎng)膜類器官進(jìn)行對照。相比OVB類器官，視網(wǎng)膜類器官呈典型球形(圖2D)。OVB-organoids中的觀察結(jié)果在某種程度上與Capowski的1期和2期視網(wǎng)膜organoids中觀察到的結(jié)果相似，這表明OVB-organoids包含有用于光受體發(fā)育的細(xì)胞。通過F-actin和Arl13b標(biāo)記外層細(xì)胞膜和初生纖毛，共聚焦圖像顯示有組織的色素細(xì)胞呈現(xiàn)典型的蜂窩狀形態(tài)，每個細(xì)胞都含有初生纖毛(圖2K)。
 
然后作者研究了OVB類器官是否含有原始晶狀體和角膜上皮樣細(xì)胞等來自于表面外胚層的非神經(jīng)元細(xì)胞類型。共聚焦圖像顯示位于每個視神經(jīng)囊泡內(nèi)的雙側(cè)aA/ ab -晶體蛋白陽性(圖3A)，這些結(jié)構(gòu)被一層F -actin和Keratin-3陽性柱狀上皮細(xì)胞包圍，表明原始角膜上皮樣層與晶狀體樣結(jié)構(gòu)相鄰(圖3B)。超微結(jié)構(gòu)觀察到一個明顯的圓形結(jié)構(gòu)，可能是前房被原始細(xì)胞所包圍角膜樣上皮(圖3C-D)。并在視神經(jīng)泡附近發(fā)現(xiàn)了PCP4陽性，PCP4陽性細(xì)胞呈典型的體細(xì)胞形態(tài)，軸突延伸至100mm，穿透出視神經(jīng)囊泡，從器官前部向后部遷移，表明陽性神經(jīng)元可能已經(jīng)從視泡遷移到更高階的視覺區(qū)域(圖3 E-F)。綜上所述，作者成功設(shè)計出具有雙側(cè)對稱視泡的大腦器官，并具有復(fù)雜產(chǎn)前眼發(fā)育的各種細(xì)胞類型(圖3G)。
  最后，作者結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，推斷OVB類器官具有皮質(zhì)神經(jīng)元突觸成熟特征并加以驗證。共聚焦結(jié)果顯示OVB表達(dá)Synapsin1陽性，成熟神經(jīng)元標(biāo)志物CTIP、髓鞘堿性蛋白(MBP)和層粘連蛋白等(圖4A-B-C-D)。為了證實功能性神經(jīng)元的存在，作者還進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗記錄，在OVB類器官的神經(jīng)元細(xì)胞中可檢測到明顯的自發(fā)動作電位，并發(fā)現(xiàn)自發(fā)動作電位對豚毒素(TTX)有時敏感、有時抵抗，說明神經(jīng)元細(xì)胞具有成熟功能，并設(shè)計光感實驗做了進(jìn)一步探索。