同立海源新品試用：GMP級(jí)基因編輯利器CAS9核酸酶

CRISPR-Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA，可以將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR序列中，通過(guò)相應(yīng)的CRISPR RNAs（crRNAs）來(lái)指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)同源序列的降解，進(jìn)而提供免疫性。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的特性，科學(xué)家將其改造成了目前最高效的基因組編輯工具。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割雙鏈DNA；2013年，張鋒首次用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原核生物 (大腸桿菌) 中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來(lái)源于化膿性鏈球菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由三個(gè)原件構(gòu)成：tracrRNA+crRNA嵌合成的sgRNA（single guide RNA）+宿主DNA序列上的PAM序列（protospacer adjacent motif）+Cas9剪刀（最常用的是化膿性鏈球菌來(lái)源的SpCas9蛋白）。sgRNA引導(dǎo)Cas9剪刀到與sgRNA的5’末端堿基互補(bǔ)的（長(zhǎng)約20nt的）靶序列處，緊接這段互補(bǔ)序列下游若存在能被Cas9蛋白識(shí)別的PAM序列（SpCas9特異性識(shí)別的PAM是由3bp組成的NGG序列，N代表任意堿基），Cas9剪刀就會(huì)用兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC（在3～4nt upstream of PAM的位點(diǎn)）剪開DNA兩條鏈，最終形成雙鏈斷裂double-strandedbreak (DSB)。

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基因敲除（Knock-out）  簡(jiǎn)稱KO

Cas9蛋白可以對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細(xì)胞會(huì)采用高效的非同源末端連接方式對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。但是，在修復(fù)過(guò)程中通常會(huì)發(fā)生堿基插入或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象，造成移碼突變使靶標(biāo)基因失去功能，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性，可將Cas9的一個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，形成只能對(duì)DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9核酸酶，想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計(jì)兩條sgRNA序列，兩條sgRNA特異性的靶向結(jié)合DNA互補(bǔ)的兩條鏈的靶標(biāo)序列，即可形成DNA斷裂，并在修復(fù)過(guò)程中通過(guò)移碼突變實(shí)現(xiàn)基因敲除。

基因敲入（Knock-in） 簡(jiǎn)稱KI

當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中，基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因敲入。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行；或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ，提高HDR的效率。

多重編輯（Multiplex Editing）

將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。

功能基因組篩選

目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對(duì)表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對(duì)化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫(kù)對(duì)潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。