超維景助力北京大學(xué)微型化三光子顯微鏡問世

瀏覽次數(shù)：1447　發(fā)布日期：2023-3-3　來源：超維景公眾號

深腦成像的利器：超維景助力北京大學(xué)微型化三光子顯微鏡問世

2023年2月23日，北京大學(xué)程和平-王愛民團(tuán)隊在Nature Methods在線發(fā)表題為 Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection的文章。

文中報道了重量僅為2.17克的微型化三光子顯微鏡（圖1），首次實現(xiàn)對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經(jīng)元功能成像，為揭示大腦深部結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)機(jī)制開啟了新的研究范式。

圖1 小鼠佩戴微型化三光子顯微鏡實景圖

解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜是我國和世界多國腦計劃的一個重點研究方向，為此需要打造自由運動動物佩戴式顯微成像類研究工具。2017年，北京大學(xué)程和平院士團(tuán)隊成功研制第一代 2.2 克微型化雙光子顯微鏡，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦皮層神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動的動態(tài)圖像。2021年，該團(tuán)隊的第二代微型化雙光子顯微鏡將成像視野擴(kuò)大了 7.8 倍，同時具備獲取大腦皮層上千個神經(jīng)元功能信號的三維成像能力。

01
微型化三光子顯微鏡突破成像深度極限

海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個毫米。由于大腦組織，特別是胼胝體，具有對光的高散射光學(xué)特性，所以突破成像深度極限是長期以來困擾神經(jīng)科學(xué)家的一個極大的挑戰(zhàn)。此前的微型化單光子及微型化多光子顯微鏡均無法實現(xiàn)穿透全皮層直接對海馬區(qū)進(jìn)行無損成像。

此次，北京大學(xué)最新研發(fā)的微型化三光子顯微鏡一舉突破了此前微型化多光子顯微鏡的成像深度極限：
1、顯微鏡激發(fā)光路可以穿透整個小鼠大腦皮層和胼胝體，實現(xiàn)對小鼠海馬CA1亞區(qū)的直接觀測記錄（圖2，Video 1-2）。神經(jīng)元鈣信號最大成像深度可達(dá)1.2 mm，血管成像深度可達(dá)1.4 mm。
2、在光毒性方面，全皮層鈣信號成像僅需要幾個毫瓦，海馬鈣信號成像僅需要20至50毫瓦，大大低于組織損傷的安全閾值。因此，該款微型化三光子顯微鏡可以長時間、不間斷連續(xù)觀測神經(jīng)元功能活動，且不產(chǎn)生明顯的光漂白與光損傷。

圖2 微型三光子顯微成像記錄小鼠大腦皮層L1-L6和海馬CA1的結(jié)構(gòu)和功能動態(tài)。CC：胼胝體。綠色代表GCaMP6s標(biāo)記的神經(jīng)元熒光鈣信號，洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質(zhì)界面的三次諧波信號。

video1：這是使用北大微型化三光子顯微鏡拍攝的小鼠大腦從大腦皮層到胼胝體再到海馬CA1亞區(qū)的三維重建圖。綠色代表GCaMP6s標(biāo)記的神經(jīng)元熒光信號，洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質(zhì)界面的三次諧波信號。左上角顯示成像深度，可以看到，激光進(jìn)入大腦，以硬腦膜作為0點，向下移動z軸位移臺，我們一次看到了皮層L1至L6分層的神經(jīng)元胞體和微血管，之后我們看到了胼胝體致密的纖維結(jié)構(gòu)。在穿過胼胝體后，我們繼續(xù)向下，我們終于看到了位于海馬CA1亞區(qū)的神經(jīng)元胞體。

video2：左下圖是小鼠佩戴著微型化三光子探頭，在鼠籠(長29厘米× 17.5厘米寬× 15厘米高)中自由探索。左上圖是此時小鼠佩戴的微型化三光子探頭正在對深度為978 μm的海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)元熒光鈣信號進(jìn)行成像（幀率8.35Hz，物鏡后的光功率為35.9 mW）。右圖展示了左上圖中10個神經(jīng)元的鈣活動軌跡，尖峰代表鈣信號發(fā)放。鈣活動軌跡上移動的藍(lán)線與小鼠自由行為視頻同步。

02
全新的光學(xué)構(gòu)型設(shè)計

北京大學(xué)微型化三光子顯微鏡成像深度的突破得益于全新的光學(xué)構(gòu)型設(shè)計。（圖3）

圖3 微型化三光子顯微鏡光學(xué)構(gòu)型

通過對皮層、白質(zhì)和海馬體建立分層散射模型進(jìn)行仿真，發(fā)現(xiàn)熒光信號從深層組織到達(dá)腦表面時已經(jīng)處于隨機(jī)散射的狀態(tài)，使得顯微物鏡熒光收集效率降低，從而極大限制了成像深度。針對這一問題，經(jīng)典阿貝聚光鏡結(jié)構(gòu)被引入構(gòu)型設(shè)計中：微型阿貝聚光鏡與簡化的無限遠(yuǎn)物鏡密接可以提高散射光的通透效率；阿貝聚光鏡與激發(fā)光路中的微型管鏡部分復(fù)用，可以進(jìn)一步簡化結(jié)構(gòu)，降低損耗。總體上，新微型化顯微鏡的散射熒光收集效率實現(xiàn)了成倍的提升。

03
生物應(yīng)用

同時，利用微型化三光子顯微鏡，作者研究了小鼠頂葉皮層第六層神經(jīng)元在抓取糖豆這一感覺運動過程中的編碼機(jī)制：發(fā)現(xiàn)大約37%的神經(jīng)元在抓取動作之前就開始活躍且在抓取時最活躍，大約5.6%的神經(jīng)元在抓取動作之后開始活躍，說明不同神經(jīng)元參與了不同階段的編碼。（圖4，Video 3）這一結(jié)果初步展示了微型化三光子顯微鏡在腦科學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。

圖4 小鼠頂葉皮層第六層神經(jīng)元在抓取糖豆任務(wù)中的不同反應(yīng)類型

video3：左圖是佩戴著微型化三光子顯微鏡的小鼠在0.5厘米狹縫中用手抓取糖豆吃。中間圖是此時微型化三光子顯微鏡探頭拍攝的PPC腦區(qū)皮層第6層神經(jīng)元（位于650微米深度）熒光鈣信號（GCaMP6s標(biāo)記的神經(jīng)元，幀率15.93 Hz）。右圖是選取中間圖中5個神經(jīng)元的鈣活動軌跡，其中每條綠線表示一次小鼠的抓取動作。移動的藍(lán)色線與左圖的小鼠行為視頻以及中間圖中的神經(jīng)元活動同步。視頻以正常(×1)、慢速(×0.5)和快速(×10)的速度播放，以便于查看抓取行為。

北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士后趙春竹、北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生陳詩源、北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)南京轉(zhuǎn)化研究院研究員張立風(fēng)為該論文的共同第一作者，北京大學(xué)程和平、王愛民、趙春竹為論文的共同通訊作者，北京超維景生物科技有限公司胡炎輝、李誼軍、陳燕川、付強、高玉倩、江文茂、張穎也參與了此項工作的開發(fā)。該項目得到科技創(chuàng)新2030-“腦科學(xué)與類腦研究”重大項目、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程—腦疾病的線粒體機(jī)制研究創(chuàng)新單元、國家自然科學(xué)基金委、國家重大科研儀器研制專項、科技部重點研發(fā)計劃等經(jīng)費支持。

超維景一直致力于前沿生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化，為推動生命科學(xué)的研究與發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)的、系統(tǒng)化的解決方案。

經(jīng)過多年的沉淀
我們即將推出自主研發(fā)的
最新一代微型化三光子顯微成像系統(tǒng)
敬請期 待！

Nature Methods 原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3

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