請(qǐng)問(wèn)你能介紹一下你自己以及你在SPT Labtech公司的角色嗎？

我叫Huw Rees。作為SPT Labtech北美現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用科學(xué)團(tuán)隊(duì)的一員，我為我們液體處理解決方案的用戶(hù)提供專(zhuān)家培訓(xùn)和應(yīng)用建議，這些方案包括mosquito®、firefly®和dragonfly®。

NGS中的文庫(kù)制備是什么，為什么要自動(dòng)化？

NGS文庫(kù)制備通常包含幾個(gè)關(guān)鍵部分，下面列出了需要液體處理的關(guān)鍵步驟：

幾乎所有試劑盒都需要進(jìn)行DNA末端制備，即對(duì)末端進(jìn)行修飾，使其適合后續(xù)測(cè)序。之后是純化步驟，以去除初始制備步驟中的酶和其他試劑。

PCR之后，下一步是在將樣品放入測(cè)序儀之前再次進(jìn)行純化。這些試劑盒非常適合自動(dòng)化，因?yàn)槭謩?dòng)操作既費(fèi)力又耗時(shí)。特別是對(duì)于多孔板來(lái)說(shuō)，手動(dòng)準(zhǔn)備這些試劑盒需要數(shù)小時(shí)精確、專(zhuān)注的工作，而且很難掌握。

很難找到能夠迅速、一致且有效地操作這些試劑盒的有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室工作人員。自動(dòng)化這個(gè)過(guò)程降低了對(duì)專(zhuān)業(yè)技能的需求并且使科學(xué)家能夠?qū)Ｗ⒂谒麄冄芯康钠渌�部分�?/p>

自動(dòng)液體處理器可以移液的體積低于手持移液器能夠處理的體積。使用手持式移液管很難進(jìn)行微升以下的體積操作，但自動(dòng)化可以持續(xù)穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

將NGS文庫(kù)制備微縮化有哪些好處？這對(duì)每個(gè)樣品的成本有何影響？

將NGS文庫(kù)制備微縮化很重要，因?yàn)樗�能讓您的投資發(fā)揮更大的作用。雖然文庫(kù)制備試劑盒效果不錯(cuò)，但由于其制備涉及的費(fèi)用（如蛋白質(zhì)工程和廣泛的研究），因此每個(gè)樣品的成本通常都很高。

通過(guò)將這些試劑盒微縮化，您可以顯著減少每個(gè)反應(yīng)所需的體積，從而允許您使用相同數(shù)量的試劑處理更多樣品，從而節(jié)省資金。此外，自動(dòng)化通過(guò)提高實(shí)驗(yàn)室通量進(jìn)一步增強(qiáng)了這一點(diǎn)優(yōu)勢(shì)。微縮化還減少了您對(duì)手動(dòng)移液的依賴(lài)，提供了無(wú)人值守的時(shí)間，并提高了您工作流程中樣品的通量。

實(shí)驗(yàn)室如何實(shí)現(xiàn)更顯著的微縮化？

在高讀取深度的試劑盒中可以實(shí)現(xiàn)更顯著的微縮化。例如，NEBNext Ultra II DNA試劑盒可以在mosquito上縮小約十倍，讓您的試劑盒效能提升十倍，從而讓您節(jié)省成本。其他試劑盒也可以縮小到類(lèi)似的程度，甚至更多。

您能多談?wù)勱P(guān)于mosquito以及它是如何通過(guò)微縮化來(lái)實(shí)現(xiàn)投資回報(bào)率（ROI）最大化的嗎？

“Mosquito”是我們?cè)O(shè)計(jì)的納升級(jí)液體處理儀器，旨在通過(guò)微縮化實(shí)現(xiàn)投資回報(bào)率（ROI）的最大化。Mosquito的槍頭被裝載在儀器頂部的針卷上，該針卷將它們送入移液頭中。這個(gè)移液頭可以在五個(gè)可用的多孔板架位置上進(jìn)行吸液操作，支持96孔和384孔兩種規(guī)格。槍頭由不銹鋼制成，外層覆蓋高密度聚乙烯，確保了耐用性和精度。每個(gè)單獨(dú)的槍頭都采用了真正的固相技術(shù)，這意味著液體和槍頭之間沒(méi)有空氣柱。所以在處理低粘度或高粘度液體時(shí)，準(zhǔn)確性不會(huì)受到影響，因此它可以毫無(wú)問(wèn)題地處理非常粘稠的master mixes或易揮發(fā)的混合物，如乙醇。

mosquito 可以處理 500 nL 至 5 μL 的體積，而其低體積型號(hào)則能夠處理從 25 nL到1.2 µL的體積。在本次討論中，我將主要關(guān)注大體積型號(hào)，它具有微縮化磁珠純化的能力。

槍頭的一次性使用幾乎消除了交叉污染的可能性。mosquito 能夠從孔的最底部實(shí)現(xiàn)吸液和分液，保證了可忽略不計(jì)的死體積至最低，使基因組 DNA 和酶的處理動(dòng)作非常柔和。這對(duì)于NGS文庫(kù)制備來(lái)說(shuō)非常重要，因?yàn)樗�避免了泡沫產(chǎn)生和渦旋劇烈等可能破壞酶的問(wèn)題。

如何使用 mosquito 輕松實(shí)現(xiàn) NGS 文庫(kù)制備？

mosquito配備了一套全面的軟件系統(tǒng)，其中包括用于簡(jiǎn)化常見(jiàn) NGS 程序設(shè)置的默認(rèn)向?qū)�，如Nextera XT、NEB試劑盒和磁珠純化。該軟件還允許在我們的FAS團(tuán)隊(duì)的幫助下進(jìn)行自定義實(shí)驗(yàn)設(shè)置，使實(shí)驗(yàn)室能夠根據(jù)其特定需求對(duì)試劑盒進(jìn)行微縮化。用戶(hù)友好的軟件界面允許輕松定制和修改實(shí)驗(yàn)。

一個(gè)預(yù)加載程序的例子是 NEBNext Ultra II FS DNA 試劑盒。你將在“運(yùn)行”（Run）頁(yè)面開(kāi)始，該頁(yè)面有一個(gè)預(yù)編寫(xiě)的詳細(xì)說(shuō)明，列出了它將執(zhí)行的步驟，以及一個(gè)預(yù)估的運(yùn)行時(shí)間。

如果需要定制，你可以從“信息”（Information）頁(yè)面修改實(shí)驗(yàn)參數(shù)，該頁(yè)面提供了程序的標(biāo)題和描述。這個(gè)程序被優(yōu)化以節(jié)省試劑槍頭和時(shí)間。它還包含了片段化、末端修復(fù)、dA加尾、接頭連接和USER酶處理的步驟。

“多孔板”（Plates）標(biāo)簽頁(yè)允許你指定將要使用的多孔板類(lèi)型。如果有需要，你可以更改這些默認(rèn)設(shè)置。

在“實(shí)驗(yàn)”（Experiment）標(biāo)簽頁(yè)下，如果你運(yùn)行的樣本數(shù)量較少，你可以減少多孔板上的所需試劑放置列的數(shù)量。你還能夠修改各列被放置的位置。例如，您可以將ligation mix移至不同的多孔板列中，以減少死體積。

在將多孔板和樣本物理裝載到儀器上后，你只需點(diǎn)擊運(yùn)行即可。mosquito 隨后會(huì)將 fragmentation mix 分配到反應(yīng)板上，從而完成你的 NGS 文庫(kù)制備設(shè)置。

你能詳細(xì)介紹一下文庫(kù)制備后的純化程序嗎？

在完成初始文庫(kù)制備和DNA末端處理后，下一步是樣本純化，這涉及到使用磁珠純化程序。mosquito 軟件的向?qū)Чδ軓氖贾两K簡(jiǎn)化了這一過(guò)程，提供了一個(gè)包含了所有必要詳細(xì)信息的運(yùn)行界面。

這個(gè)程序涉及五塊板：樣本板、試劑板、樣本板在磁力架上的位置、廢液板和洗脫后純化樣本的輸出位置。

使用相似的向?qū)Чδ�，用�?hù)可以在“多孔板”（Plates）標(biāo)簽頁(yè)下自定義多孔板的類(lèi)型，并在“實(shí)驗(yàn)”（Experiment）標(biāo)簽頁(yè)中調(diào)整磁珠純化程序，例如磁珠比例、乙醇洗滌次數(shù)以及是否包含乙醇孵育步驟。用戶(hù)還可以選擇運(yùn)行的樣本數(shù)量，并為磁珠、乙醇和其他試劑指定所處列的位置。

一旦設(shè)置好多孔板，mosquito 會(huì)向樣本中添加磁珠，并對(duì)多孔板進(jìn)行渦旋振蕩和離心。在與樣本進(jìn)行磁珠孵育后，將多孔板放置在磁力架上進(jìn)行乙醇洗滌步驟，mosquito 會(huì)通過(guò)添加和移除乙醇來(lái)處理。

然后，將多孔板從磁力架上移開(kāi)，加入洗脫緩沖液以重新懸浮磁珠，然后將多孔板重新放回磁力架上，以確保最終樣本中不含有任磁珠。

這個(gè)程序只是mosquito支持的眾多工作流程之一。我們擁有大量的引用文獻(xiàn)和相關(guān)材料，支持從始至終的不同程度的微縮化完整NGS工作流程。

你能舉個(gè)例子說(shuō)明mosquito如何降低每個(gè)樣本的成本嗎？

市場(chǎng)上兩種強(qiáng)大且知名的試劑盒是Illumina Nextera XT和Illumina DNA制備試劑盒。通過(guò)使用mosquito，我們始終如一地實(shí)現(xiàn)了十倍微縮化——在Nextera XT的情況下更是達(dá)到了12.5倍——從而顯著降低了每個(gè)樣本的成本。

例如，使用384孔樣本板，您只需處理八塊整板就能支付您實(shí)驗(yàn)室中mosquito儀器的成本。這意味著您將很快看到投資回報(bào)。在一些實(shí)驗(yàn)室中，這種高通量水平是很常見(jiàn)的，使得mosquito能夠在幾周內(nèi)就收回成本。

您想分享一些有關(guān)Mosquito的令人興奮的更新嗎？

我們最近剛剛推出了Mosquito家族的最新成員——Mosquito Gen3。這是迄今為止我們最緊湊、最易于使用的版本，它提供了Mosquito的所有功能，但僅具有三個(gè)孔板位置和更小的占地面積。通過(guò)Gen3，我們正在降低微縮化的門(mén)檻，因此，更多的基因組學(xué)研究人員可以從減少NGS體積的成本節(jié)約中受益。