精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記染色

精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（ConA-FITC）染色試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（ConA-FITC）染色試劑是一種旨在使用熒光素標(biāo)記的刀豆素A凝集素和赫斯特33258雙重?zé)晒馊旧�技術(shù)，分析生理性反應(yīng)性或病理性退行性頂體缺失的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物（例如猴、豬等）或人體精子細(xì)胞以及凍存精子細(xì)胞，包括睪丸中、附睪中以及射精后的精子細(xì)胞的頂體狀態(tài)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

 

技術(shù)背景

 

在男科學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運(yùn)動(dòng)能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評價(jià)是精子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。其中頂體反應(yīng)，是指當(dāng)精子接近卵子實(shí)施授精時(shí)，精子頭部前半端的帽狀結(jié)構(gòu)頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應(yīng)測試是一項(xiàng)穩(wěn)定的精子功能參數(shù)，可以用于預(yù)測受精成功率。因此頂體的結(jié)構(gòu)完整性（intact）是評價(jià)的主要標(biāo)志，也是不育癥和避孕藥物研究的對象。使用熒光素標(biāo)記的無毒性的刀豆素A凝集素（Isothiocyano fluoresceinated -Concanavalin A；ConA-FITC）和赫斯特33258（Hoechst 33258）雙重?zé)晒馊旧�技術(shù)，是精子頂體反應(yīng)分析和授精效率評價(jià)的最常用的方法。首先使用赫斯特33258染色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特點(diǎn)，受到活體精子細(xì)胞（包括游動(dòng)性和非游動(dòng)性精子）的排斥，而容易進(jìn)入死亡精子細(xì)胞。其次使用熒光素標(biāo)記的刀豆素A凝集素染料，與頂體內(nèi)膜表面糖復(fù)合物上的葡萄糖或甘露糖糖基的反應(yīng)。當(dāng)頂體內(nèi)容物缺失，使染料與暴露的內(nèi)膜結(jié)合，顯示綠色熒光，即反應(yīng)性（reacted）頂體。雙染的作用，以幫助區(qū)分生理性反應(yīng)性頂體缺失（loss）或病理性退行性頂體缺失。通過常用的熒光顯微鏡（激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm）便可清晰觀察到綠色頂體缺失狀態(tài)（status）。  

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

保存液（Reagent A）   50毫升

染色液A（Reagent B）  250微升

清理液（Reagent C）   30毫升

固著液（Reagent D）   10毫升

染色液B（Reagent E）    2毫升

產(chǎn)品說明書    1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；染色液A和B（Reagent B和E）避免光照，有效保證6月

  

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機(jī)：用于樣品染色操作的容器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

載玻片和蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 移取新鮮獲得的1毫升精液（48小時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升保存液（Reagent A），混勻顆粒群
• 在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整到2 X 10⁷精子細(xì)胞/毫升
• 移取100微升精子細(xì)胞到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升染色液A（Reagent B），混勻
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升清理液（Reagent C），混勻顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14一次
• 加入500微升固著液（Reagent D），混勻顆粒群
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入100微升保存液（Reagent A），混勻顆粒群
• 即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端
• 用蓋玻片或另一個(gè)載玻片推片
• 置于空氣中涼干
• 小心加上100微升染色液B（Reagent E），覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 小心加上200微升清理液（Reagent C），覆蓋樣品表面
• 小心抽去清理液
• 蓋上蓋玻片或封片液
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)精子）

 

觀察藍(lán)色熒光—染色液A（Reagent B）：濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm ――可見藍(lán)色熒光，表明死亡精子細(xì)胞

 

觀察綠色熒光—染色液B（Reagent E）：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子頂體區(qū)域

 

• 分析結(jié)果

染色結(jié)果	說明	意義
頂體明亮綠色熒光	頂體缺失（loss）	反應(yīng)頂體（Reacted acrosome）
精子頭部無熒光	完整頂體（intact/whole acrosome）	未反應(yīng)頂體（unreacted acrosome
根據(jù)藍(lán)色熒光的有無，確定為生理性或病理性

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品可以與各種免疫抗體進(jìn)行雙染
• 本產(chǎn)品不適合分析精卵細(xì)胞反應(yīng)的頂體狀態(tài)
• 操作時(shí)須戴手套
• 樣品檢測前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)10⁴。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：

1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 10⁴（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升

• 染色完成后，即刻進(jìn)行檢測分析
• 用戶可以使用鈣離子載體A23187或Ionomycin誘導(dǎo)精子頂體缺失
• 反應(yīng)性頂體（reacted  acrosome）或缺失性頂體（loss）參考圖像如下：

 

 

• 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰