CRISPR/Cas9基因敲除鼠技術(shù)服務(wù)*

  制作原理

       CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。 CRISPR 是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機(jī)制。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點剪切雙鏈DNA達(dá)到對基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)π∈蠛痛笫蠡�因組特定基因位點進(jìn)行精確編輯， 目前已經(jīng)成功應(yīng)用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。

服務(wù)流程和周期

CRISPR/Cas9流程圖

      Cas9結(jié)合gRNA，gRNA 的長度約為80 個核苷酸，包含兩個區(qū)域：gRNA 5' 端前20 個核苷酸對應(yīng)于靶標(biāo)DNA，能 結(jié)合在靶DNA 上的約60 個核苷酸（gRNA 長度取決于表達(dá)gRNA 的質(zhì)粒）形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)能幫助 gRNA 與Cas9 結(jié)合，并由此指導(dǎo)與DNA 的結(jié)合。
通過gRNA上的靶點序列，在目標(biāo)基因組上找到靶點序列，并揭開雙螺旋， Cas9將剪切DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂。Cas9使用簡單，可滿足多個靶點同時操作。

CRISPR/Cas9技術(shù)特點

1、可實現(xiàn)對靶基因多個位點或多個基因同時敲除；

2、實驗周期短，價格低；

3、可應(yīng)用于大、小鼠等，無物種限制。

服務(wù)類型

1、全身性基因敲除

2、點突變

3、小片段基因敲入

4、雙/多基因敲除

建系原則與流程

1、CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的基因敲除鼠，由于是在大鼠或者小鼠的鼠原核受精卵期進(jìn)行的修飾，獲得的F0鼠一般也是雜合子，并且每只FO鼠由于移碼突變情況可能不一樣，所以每只F0鼠也需要作為一個獨立的譜系進(jìn)行傳代；

2、原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠，F(xiàn)0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠（可能有多種突變類型的F1）；

3、選擇來自同一只F0代鼠，突變類型一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后與進(jìn)行同胞交配，可獲得F2代鼠。對交配獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測序鑒定，理論上， F2代鼠中25%為相同突變型的純合子鼠，有50%為只有一條染色體突變的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。