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CRISPR-Pro技術(shù)采用獨特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復路徑，大大提高同源重組效率，使得DNA大片段敲入（KI）及條件性敲除（cKO）得以實現(xiàn)。
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CRISPR-Pro技術(shù)原理
Cas9/gRNA復合物在靶位點進行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB：Double-strand break），迫使細胞進行緊急修復。通常條件下，細胞偏向于使用非同源末端連接（NHEJ：nonhomologous DNA end joining）的方式對斷裂的雙鏈進行修復，進而造成靶位點基因的插入/缺失突變。CRISPR-Pro技術(shù)采用獨特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復路徑，大大提高同源重組效率，使得DNA大片段敲入（KI）及條件性敲除（cKO）得以實現(xiàn)。
CRISPR-Pro技術(shù)優(yōu)勢
1）周期短，效率高；
2）高嵌合率，生殖遺傳穩(wěn)定；
3）可實現(xiàn)DNA大片段敲入（長達10Kb）；
4）可實現(xiàn)條件性敲除（長達4kb）；
5）可實現(xiàn)大片段敲除（長達20kb）。
Jackson Lab CRISPR/Cas9基因編輯效率 VS Cyagen CRISPR-Pro基因編輯效率
| 項目類型 | 基因敲除效率對比 | |
| CRISPR/Cas9(Jackson Lab) | CRISPR-Pro(Cyagen) | |
| 基因移碼敲除 | 高效 | 高效 |
| 基因片段敲除 | 高效 | 高效 |
| 點突變/小標簽基因敲入 | 一般 | 高效 |
| cDNA片段基因敲入（≤4kb） | 效率較低 | 高效，可長達10kb |
| 條件性基因敲除 | 效率較低 | 高效，可長達4kb |
與Jackson Lab展示的CRISPR/Cas9基因編輯效率相比，賽業(yè)生物（Cyagen）CRISPR-Pro在敲入片段長度與敲入效率方面都更具優(yōu)勢。
CRISPR-Pro服務(wù)流程與周期
CRISPR-Pro基因敲除常用大小鼠模型
完全性基因敲除鼠
CRISPR-Pro完全性基因敲除鼠是通過CRISPR /Cas9基因敲除技術(shù)，針對靶基因設(shè)計和構(gòu)建gRNA與Cas9表達質(zhì)粒，造成目的基因的功能區(qū)域被敲除，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。
CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移碼突變、片段基因敲除、雙/多基因敲除。
移碼突變鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、選擇來自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達到性成熟后進行互配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
片段基因敲除鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因不同位點設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的一對gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、選擇來自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達到性成熟后互配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
雙（多）基因敲除鼠的建系原則與流程
1、通過針對兩個靶基因分別設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代多基因雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雙基因雜合子鼠；
3、選擇雙基因雜合子鼠進行雜交，獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定。
條件性基因敲除鼠
條件性基因敲除是通過把兩個LoxP位點插入到目的基因的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出有兩個floxed小鼠。該floxed小鼠在與表達Cre重組酶小鼠雜交之前，該基因表達正常；當floxed小鼠與組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交后，可實現(xiàn)在特定的組織或細胞中敲除該基因，而在其它組織或細胞中該基因表達正常。
建系原則與流程：
1、與野生型小鼠雜交：陽性CRISPR-Pro小鼠（+/flox）與野生型小鼠（+/+）雜交，獲得F1代雜合子小鼠（+/flox）；
2、挑選一對F1代雜合子小鼠（+/flox）進行自交，獲得F2代純合子小鼠（flox/flox）。
基因敲入鼠
CRISPR-Pro基因敲入鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的 gRNA質(zhì)粒和donor vector，通過Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組，引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點突變(模擬人類遺傳疾病模型)或?qū)蟾婊?如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位點，從而可以通過報告基因來跟蹤目標基因的表達；也可以用報告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同時發(fā)生。
CRISPR-Pro基因敲入鼠包括：點突變、片段基因敲入。
點突變鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)錄為RNA，再合成含有突變位點信息的donor oligo，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、 選擇來自同一只F0代鼠，敲入位點一致的F1代鼠，達到性成熟后進行同胞交配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
片段基因敲入的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒和含有突變位點信息的donor vector，將以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為mRNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR鑒定基因型和測序鑒定隨機插入的F1代雜合子鼠；
3、 選擇來自同一只F0代鼠，敲入位點一致的F1代鼠，達到性成熟后進行同胞交配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
Rosa26定點基因敲入小鼠
指在Rosa26位點插入某種基因的基因敲入小鼠模型（也稱轉(zhuǎn)基因小鼠模型）。Rosa26位點基因敲入小鼠模型不僅插入位點精準，同時由于Rosa26是安全區(qū)域，所以外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達；而且由于是單拷貝基因插入，因此更容易預測表達量；結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可使外源基因在特定組織及特定時間穩(wěn)定表達，可用來高效構(gòu)建多用途的條件性基因敲入小鼠模型，因此越來越受到科研人員的青睞。
構(gòu)建原理圖：
Rosa26位點基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）
Rosa26位點條件性基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢：
1. 外源基因的重組位置確定，更有利于表達；
2. 結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可以使外源基因在特定組織及特定時間表達；
H11位點基因敲入小鼠
Rosa26是一個經(jīng)典的基因插入位點，雖然對于Rosa26位點的研究較多，但制作多基因插入小鼠時仍需要其他合適的插入位點。H11（Hipp11）是另一個可供選擇的插入位點，也是一個安全區(qū)域，在此位點的插入基因不會影響其他基因表達，同時此插入基因的表達也不會受到周邊區(qū)域的影響。
H11位于小鼠 11 號染色體，是位于Eif4enif1與Drg1兩個基因之間的一個位點，于 2010 年由 Hippenmeyer S.發(fā)現(xiàn)，整合到 H11 位點的外源基因可以穩(wěn)定高效的表達。利用Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)，可將外源的基因片段定點插入到小鼠的H11位點。與Rosa26相比，其優(yōu)點是不受旁側(cè)啟動子影響，因此更合適用于表達外源基因。結(jié)合loxp系統(tǒng)，可構(gòu)建組織特異性表達小鼠模型。
構(gòu)建原理圖：
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢：
1. 穩(wěn)定性高，后代表達一致；
2. 實用性強，能實現(xiàn)A基因在Rosa26位點及B基因在H11位點同時過表達；
3. 經(jīng)濟實惠，F(xiàn)1代即可開始實驗。
CRISPR-Pro服務(wù)流程與周期
CRISPR-Pro基因敲除常用大小鼠模型
完全性基因敲除鼠
CRISPR-Pro完全性基因敲除鼠是通過CRISPR /Cas9基因敲除技術(shù)，針對靶基因設(shè)計和構(gòu)建gRNA與Cas9表達質(zhì)粒，造成目的基因的功能區(qū)域被敲除，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。
CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移碼突變、片段基因敲除、雙/多基因敲除。
移碼突變鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、選擇來自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達到性成熟后進行互配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
片段基因敲除鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因不同位點設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的一對gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、選擇來自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達到性成熟后互配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
雙（多）基因敲除鼠的建系原則與流程
1、通過針對兩個靶基因分別設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代多基因雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雙基因雜合子鼠；
3、選擇雙基因雜合子鼠進行雜交，獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定。
條件性基因敲除鼠
條件性基因敲除是通過把兩個LoxP位點插入到目的基因的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出有兩個floxed小鼠。該floxed小鼠在與表達Cre重組酶小鼠雜交之前，該基因表達正常；當floxed小鼠與組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交后，可實現(xiàn)在特定的組織或細胞中敲除該基因，而在其它組織或細胞中該基因表達正常。
建系原則與流程：
1、與野生型小鼠雜交：陽性CRISPR-Pro小鼠（+/flox）與野生型小鼠（+/+）雜交，獲得F1代雜合子小鼠（+/flox）；
2、挑選一對F1代雜合子小鼠（+/flox）進行自交，獲得F2代純合子小鼠（flox/flox）。
基因敲入鼠
CRISPR-Pro基因敲入鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的 gRNA質(zhì)粒和donor vector，通過Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組，引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點突變(模擬人類遺傳疾病模型)或?qū)蟾婊?如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位點，從而可以通過報告基因來跟蹤目標基因的表達；也可以用報告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同時發(fā)生。
CRISPR-Pro基因敲入鼠包括：點突變、片段基因敲入。
點突變鼠的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)錄為RNA，再合成含有突變位點信息的donor oligo，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠；
3、 選擇來自同一只F0代鼠，敲入位點一致的F1代鼠，達到性成熟后進行同胞交配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
片段基因敲入的建系原則與流程
1、通過針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒和含有突變位點信息的donor vector，將以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為mRNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配，獲得PCR鑒定基因型和測序鑒定隨機插入的F1代雜合子鼠；
3、 選擇來自同一只F0代鼠，敲入位點一致的F1代鼠，達到性成熟后進行同胞交配，可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
Rosa26定點基因敲入小鼠
指在Rosa26位點插入某種基因的基因敲入小鼠模型（也稱轉(zhuǎn)基因小鼠模型）。Rosa26位點基因敲入小鼠模型不僅插入位點精準，同時由于Rosa26是安全區(qū)域，所以外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達；而且由于是單拷貝基因插入，因此更容易預測表達量；結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可使外源基因在特定組織及特定時間穩(wěn)定表達，可用來高效構(gòu)建多用途的條件性基因敲入小鼠模型，因此越來越受到科研人員的青睞。
構(gòu)建原理圖：
Rosa26位點基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）
Rosa26位點條件性基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢：
1. 外源基因的重組位置確定，更有利于表達；
2. 結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可以使外源基因在特定組織及特定時間表達；
H11位點基因敲入小鼠
Rosa26是一個經(jīng)典的基因插入位點，雖然對于Rosa26位點的研究較多，但制作多基因插入小鼠時仍需要其他合適的插入位點。H11（Hipp11）是另一個可供選擇的插入位點，也是一個安全區(qū)域，在此位點的插入基因不會影響其他基因表達，同時此插入基因的表達也不會受到周邊區(qū)域的影響。
H11位于小鼠 11 號染色體，是位于Eif4enif1與Drg1兩個基因之間的一個位點，于 2010 年由 Hippenmeyer S.發(fā)現(xiàn)，整合到 H11 位點的外源基因可以穩(wěn)定高效的表達。利用Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)，可將外源的基因片段定點插入到小鼠的H11位點。與Rosa26相比，其優(yōu)點是不受旁側(cè)啟動子影響，因此更合適用于表達外源基因。結(jié)合loxp系統(tǒng)，可構(gòu)建組織特異性表達小鼠模型。
構(gòu)建原理圖：
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢：
1. 穩(wěn)定性高，后代表達一致；
2. 實用性強，能實現(xiàn)A基因在Rosa26位點及B基因在H11位點同時過表達；
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