TurboKnockout基因敲除小鼠

傳統(tǒng)ES打靶基因敲除：構建周期長達12個月，存在嵌合體階段
傳統(tǒng)ES打靶基因敲除因嵌合體陽性率較低，并且需要與工具鼠交配才能獲得刪除Neo的雜合子，因此構建周期長達10-12個月。如何跨越“嵌合體”階段并自刪除Neo以減少兩代繁育時間，才是真正快速的關鍵。
                  
 
TurboKnockout基因敲除：實現(xiàn)跨越“嵌合體”階段且自刪除Neo，減少兩代繁育時間
基于ES打靶技術的TurboKnockout技術采用了獨特的建系和基因改造技術，建立了具有高效遺傳優(yōu)勢的TurboKnockout ES細胞系，通過特定胚胎發(fā)育階段的顯微注射，使TurboKnockout ES細胞100%代替內源ES細胞，從而實現(xiàn)跨越“嵌合體”階段，把ES打靶構建周期縮短至6-8個月。并且TurboKnockout采用獨特的Self-deleting Neo Cassette所獲得的TurboKnockout小鼠與任何品系小鼠交配，都可以100%自刪除Neo。也就是說，TurboKnockout不僅實現(xiàn)跨越“嵌合體”階段，還能真正自刪除Neo，從而快速獲得去除Neo的雜合子小鼠。
                  
 
TurboKnockout 技術對比：
                      

TurboKnockout 技術優(yōu)勢：
                  
1、基因修飾準確、效果穩(wěn)定；
2、沒有脫靶效應，可勝任復雜的基因敲除；
3、自刪除Neo可進一步縮短服務周期，簡化了小鼠交配流程。
  
服務流程                   

 服務周期對比
 

 
小鼠品系

ES細胞品系：C57BL/6N

TurboKnockout 基因敲除小鼠模型

完全性基因敲除小鼠

完全性基因敲除是通過基因敲除技術，把需要敲除目的基因的所有外顯子或幾個重要的外顯子或者功能區(qū)域敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。
 
應用

用于研究某個基因（要求該基因非胚胎致死性基因）對全身生理病理的功能。

 
建系原則與流程
                
1、去除抗性基因 Neo：選擇陽性TurboKnockout小鼠與野生型小鼠雜交，獲得去除打靶載體中的 Neo 基因的F1 代雜合子KO（+/-）；
            
2、再挑選一對F1 代雜合子KO小鼠進行自交，通過 PCR 鑒定篩選得到去除Neo的純合子KO小鼠（-/-）。
             

條件性基因敲除小鼠 
               
條件性基因敲除是通過把兩個LoxP位點插入到目的基因的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出有兩個loxP位點的TurboKnockout-floxed小鼠，TurboKnockout-floxed小鼠在與表達Cre重組酶小鼠雜交之前，目的基因表達完全正常；而當TurboKnockout-floxed小鼠與組織特異性表 達Cre酶的小鼠進行雜交后，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細胞表達正常。
                  
應用
                
1、用于具有胚胎致死性目的基因的研究；
2、用于研究基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能；
3、與控制Cre表達的其它誘導系統(tǒng)相結合，還可以對某一基因的表達同時實現(xiàn)在時間和空間兩方面的調控。

 

建系原則與流程
              
1、與Cre小鼠雜交：TurboKnockout-floxed小鼠與組織特異性的Cre小鼠雜交，獲得去除Neo抗性且單條染色體有缺失的陽性F1代組織特異性cKO雜合子小鼠（+/-）；
2、挑選一對F1 代小鼠進行自交， 通過 PCR 鑒定篩選得到組織特異性去除基因的F2代cKO純合子小鼠（-/-）。                 

基因敲入小鼠  
                     
基因敲入可以在目的基因位置引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點突變(模擬人類遺傳疾病模型) ；或將報告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點，從而可以通過報告基因來跟 蹤目標基因的表達。也可以用報告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同時發(fā)生。
 
應用
                 
1、用于藥物篩選相關研究；
2、用于信號通路的研究；
3、用于示蹤的相關研究。
 

 
建系原則與流程

1、去除抗性基因 Neo：選擇陽性TurboKnockout KI小鼠與野生型小鼠雜交，獲得去除打靶載體中的 Neo 基因的雜合子F1 代小鼠；
2、再挑選一對雜合子F1 代小鼠進行自交，通過 PCR 鑒定篩選得到去除Neo的F2代純合子KI小鼠。
            
  
 
人源化小鼠 (服務于輝瑞、阿斯利康、恒瑞醫(yī)藥等知名藥企)
              
人源化小鼠模型是指帶有功能性的人類基因、細胞或組織的小鼠模型。這種模型通常被用于人類疾病體內研究(in vivo study)的活體替代模型。由于人類生理與動物生理有顯著的差別，利用動物模型得到的實驗結果有時不能適用到人體上。比如， 有些利用小鼠等動物模型開發(fā) 的藥物在人體上并沒有效果。所以，利用轉基因或同源重組的方法，將人類基因“放置”在小鼠模型上所制備的人源化小鼠模型，大大提高了這類小鼠模型作為模擬 某些人類疾病的有效性。
 
應用
                 
1、在艾滋病、癌癥、傳染病、人類退化性疾病、血液病研究領域等都有廣泛的應用；
2、藥物臨床前模擬實驗。
                     
 
 
KO-First技術制作基因敲除鼠

KO-First技術是通過在內含子中插入一個兩邊帶有FRT位點的基因破壞盒來達到敲除的目的，這個破壞盒含有Splice acceptor，報告基因和Neo。除此之外，在目的基因敲除的外顯子兩側各插入兩個LoxP位點。因此得到的小鼠是目的基因敲除同時敲入報告基因與抗性基因的小鼠。通過靈活選擇和Flp/FRT重組系統(tǒng)和Cre/LoxP重組系統(tǒng)，可達到同時獲得完全性敲除和條件性敲除的實驗目的。即當該小鼠與Flp小鼠交配時，可還原已敲除基因的表達，獲得基因條件性敲除小鼠，在此基礎上Cre小鼠交配又可獲得目的基因敲除小鼠。