轉(zhuǎn)基因小鼠

服務(wù)描述
              
制作原理
              
制作轉(zhuǎn)基因鼠最常用的一種方法是DNA原核顯微注射。DNA原核顯微注射是指將外源DNA通過顯微注射的方法注射到受精卵的原核內(nèi)，注射DNA整合到大（小）鼠受精卵的基因組中，并穩(wěn)定遺傳給后代。 賽業(yè)所使用的PiggyBac系統(tǒng)DNA顯微注射，制備的轉(zhuǎn)基因鼠基因表達(dá)陽性率為常規(guī)質(zhì)粒DNA顯微注射的2倍以上！
           
PiggyBac系統(tǒng)打造高效轉(zhuǎn)基因——技術(shù)原理：
           
 PiggyBac (PB) 系統(tǒng)是利用PB轉(zhuǎn)座子特有的“剪切和粘貼”機(jī)制，使DNA片段在載體和基因組之間“自由”的轉(zhuǎn)移，從而有效介導(dǎo)外源DNA片段對(duì)基因組的整合。轉(zhuǎn)座時(shí)，轉(zhuǎn)座酶有效的識(shí)別特異的轉(zhuǎn)座子序列(ITRs)，與轉(zhuǎn)座子末端結(jié)合形成短暫的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，“剪切”后脫離，“粘貼”至基因組的TTAA位點(diǎn)。Cyagen實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PiggyBac系統(tǒng)基因表達(dá)陽性率為常規(guī)質(zhì)粒DNA顯微注射的2倍以上！
            

 
PiggyBac （PB）系統(tǒng)五大優(yōu)勢(shì)：
                  
1、更高的整合效率；
2、更高的目的基因表達(dá)概率；
3、更大的目的片段的插入；
4、更“精確”拷貝數(shù)的插入；
5、可自由移除插入片段。
 
服務(wù)流程和周期

 
動(dòng)物品系
                      
C57BL/6小鼠：目前公布的小鼠基因組測(cè)序結(jié)果來源于C57BL/6小鼠品系。該品系小鼠模型已廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫、遺傳學(xué)等方面的研究， 并已成為發(fā)表文章的首選小鼠品系。
FVB小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比較單一；具有易于原核注射的優(yōu)點(diǎn)。
SD大鼠：適合用于研究心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等器官發(fā)育的常用模式動(dòng)物品系。
           
轉(zhuǎn)基因大（�。┦箢愋�
                  
1、過表達(dá)轉(zhuǎn)基因大（�。�
           

 
      構(gòu)建上述常規(guī)的帶有啟動(dòng)子和目的基因的表達(dá)載體， 利用原核顯微注射的方法將表達(dá)載體注射到小鼠受精卵中。通過構(gòu)建廣泛性/組織特異性/誘導(dǎo)性等不同的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在小鼠組織廣泛性/特異性/特定條件下等的表達(dá)，達(dá)到對(duì)目的基因功能的研究目的。
 
2、RNAi轉(zhuǎn)基因大（小）鼠
                     

               
　　通常采用U6/H1驅(qū)動(dòng)shRNA表達(dá)，設(shè)計(jì)靶序列構(gòu)建shRNA載體，利用原核顯微注射的方法將shRNA載體注射到受精卵中。在基因表達(dá)的過程中，通過shRNAi的干擾作用，達(dá)到對(duì)目的基因表達(dá)的沉默抑制，實(shí)現(xiàn)基因功能的研究。
              
3、microRNA轉(zhuǎn)基因大（小）鼠
                  

             
      構(gòu)建上述兩種microRNA過表達(dá)和下調(diào)載體，通過原核顯微注射將載體注射到受精卵中，通過基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)microRNA過表達(dá)或者下調(diào)。
 
4、可誘導(dǎo)性/組織特異性轉(zhuǎn)基因大（�。┦�
              

                     
      將構(gòu)建的廣泛表達(dá)啟動(dòng)子-lox-stop-lox-轉(zhuǎn)基因載體通過顯微注射制備組織特異性轉(zhuǎn)基因大（小）鼠模型，轉(zhuǎn)基因在正常情況下并不表達(dá)， 只有與相應(yīng)的組織特異性表達(dá)Cre/CreERT2小鼠雜交后，因Stop終止序列在特定的組織中被去除，從而達(dá)到轉(zhuǎn)基因在誘導(dǎo)性/特定組織中特異性表達(dá) 的目的。
 
5、BAC轉(zhuǎn)基因大（�。┦�
                    
      Bacterial artificial chromosomes（BACs）是處理大片段DNA的重要工具。由于其完整性和保真度，可以更好的解釋轉(zhuǎn)基因的重要功能。因此，為了研究完整的時(shí)空特 異性基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)及調(diào)控元件等，可以將BAC直接進(jìn)行原核顯微注射（約幾十到幾百Kb）或者將其改造后注射在小鼠或大鼠的受精卵中，以獲得轉(zhuǎn)基因鼠。
 
建系原則與流程
                         
1、原核顯微注射導(dǎo)入的目的基因是將目的基因隨機(jī)整合到小鼠或者大鼠的基因組，因此首代轉(zhuǎn)基因鼠（F0）將會(huì)有不同的整合位點(diǎn)。整合基因的拷貝數(shù)可能在不 同的首代轉(zhuǎn)基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作為一個(gè)獨(dú)立的譜系研究，并且與其它F0代鼠分開進(jìn)行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍體動(dòng)物的其中 一條染色體上，屬于半合子，其后代只有一部分個(gè)體帶有整合的基因，需要進(jìn)行篩選鑒定。
2、 原核顯微注射獲得PCR陽性F0代雜合子鼠。
3、 F0代鼠達(dá)到性成熟后（8周）與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得F1代鼠。
4、 對(duì)交配獲得的F1代鼠進(jìn)行基因型鑒定，理論上，F(xiàn)1代鼠中有50%為轉(zhuǎn)基因雜合子鼠，50%為野生型鼠。
                     

 
注意事項(xiàng)：
1）每只F0代鼠基因型都不一樣，不能進(jìn)行F0之間的自交，只能先與野生型交配，篩選出基因型一致的F1。（假如F0代有多個(gè)位點(diǎn)的外源基于整合，F(xiàn)1還有可能有多種基因型）。
2） 獲得F1鼠后，可以進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定，優(yōu)先篩選出表達(dá)的鼠后再進(jìn)行后續(xù)的傳代和保種。