1、SMART-seq
2012 年，由美國和瑞典的科學(xué)家共同開發(fā)了稱為 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技術(shù) [1]。在 2013 年，Nature Methods 雜志上報告了新的方案，被稱為 Smart-Seq2[2]，隨后在 2014 年他們有公布了詳細(xì)的操作流程 [3]。獲取單細(xì)胞并裂解細(xì)胞后，含有 oligo-dT 的引物與 mRNA 的 poly- A 結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶到達(dá) mRNA 5’末端時，MMLV 的末端轉(zhuǎn)移酶活性會在一鏈 cDNA 的 3'末端增加額外的胞嘧啶，這時 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 結(jié)合到首鏈末端的胞嘧啶，然后以首鏈 cDNA 為模版進(jìn)行延伸合成互補(bǔ)的第二鏈，全長 cDNA 經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增后進(jìn)一步進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。
▲SMART-seq2 技術(shù)原理
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1、起始量低：1 個細(xì)胞起始，適用于難以滿足 10X Genomics 等平臺起始細(xì)胞量要求的樣本。
2、覆蓋度高： 測序覆蓋 cDNA 的全長序列，每個細(xì)胞能夠獲得上萬個基因的表達(dá)。
3、信息個性化： 除了獲得基因表達(dá)信息，數(shù)據(jù)能夠用于可變剪接，cSNP 等分析，以及帶 poly- A 結(jié)構(gòu)的 lncRNA 研究。
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文庫結(jié)構(gòu)
圖 SMART-seq2 文庫示意圖
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建議測序深度及參數(shù)
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指標(biāo) |
參數(shù) |
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測序深度 |
6Gb/cell |
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測序類型 |
PE150 |
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1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量：單個細(xì)胞（或微量細(xì)胞）。
4、保存運(yùn)輸：細(xì)胞放入 SMART-seq 試劑盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰運(yùn)輸。
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2、10X Genomics
10X Genomics 公司的 Chromium 系統(tǒng)利用 8 通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，將含 barcode 的凝膠珠（Gel Beads）、細(xì)胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微體系）。GEMs 形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量 barcode 序列，隨后 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測序文庫，其中 10X barcode 用于區(qū)分細(xì)胞，UMI 用于區(qū)分 mRNA 分子。
圖 10X genomics 技術(shù)原理
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1、通量高： 一張芯片具有 8 個獨(dú)立的通道，可供 8 個樣本同時上機(jī)，每個通道可捕獲 10000 個細(xì)胞。
2、捕獲率高： 單細(xì)胞捕獲效率高達(dá) 65%，多細(xì)胞比例 <0.9%（1,000 個細(xì)胞中）。
3、延展性強(qiáng)： 除了獲得單細(xì)胞 mRNA 的信息，還提供了單細(xì)胞 TCR/BCR、單細(xì)胞表面蛋白、單細(xì)胞 ATAC 等多種解決方案。
文庫結(jié)構(gòu)
圖 10X Genomics 3’gene expression 文庫示意圖
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建議測序深度及參數(shù)
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指標(biāo) |
參數(shù) |
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測序深度 |
50,000~100,000 reads/cell |
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測序類型 |
PE150 |
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1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量及其它質(zhì)控要求：
| 樣本類型 | 樣本質(zhì)控要求 |
| 細(xì)胞懸液 | >105 目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)（底限 10,000 個細(xì)胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 濃度 500-1,000 個細(xì)胞 /ul； | |
| 細(xì)胞間無粘連（成團(tuán)率 <5%）； | |
| 無大于 40μm 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物； | |
| 不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 組織 | 0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4～5 塊。 |
4、保存運(yùn)輸：
（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。
（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。
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3、BD Rhapsody
BD Rhapsody 技術(shù)利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標(biāo)記微球上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的分子標(biāo)簽，然后將這些微球合并到單個管中用于 cDNA 擴(kuò)增和文庫構(gòu)建。可滿足 100~10000 個細(xì)胞的自動分選、擴(kuò)增及建庫。
圖 BD Rhapsody 技術(shù)原理
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此外，該技術(shù)使用帶有寡核苷酸的高質(zhì)量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細(xì)胞在經(jīng)過 Ab-oligos 標(biāo)記后，可在單細(xì)胞水平同時獲得轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)。
圖 單細(xì)胞 mRNA 與蛋白同時測序
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| 高 效 | 每個樣本可測 100~10000 個細(xì)胞； |
| 2 天內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增以及建庫。 | |
| 靈 活 | 抗體標(biāo)簽技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多樣本混合捕獲； |
| 可選擇全轉(zhuǎn)錄組測序或目標(biāo)基因測序。 | |
| 可靠 | 利用成像系統(tǒng)對單細(xì)胞捕獲過程進(jìn)行質(zhì)控； |
| 單細(xì)胞捕獲效率高達(dá) 80%，多細(xì)胞比例 <1%（1,000 個細(xì)胞中）。 | |
| 整合 | 可同時檢測單個細(xì)胞的 mRNA 水平與蛋白水平。 |
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文庫結(jié)構(gòu)
圖 BD Rhapsody 基因表達(dá)文庫示意圖
建議測序深度及參數(shù)
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指標(biāo) |
參數(shù) |
|
測序深度 |
50,000~100,000 reads/cell |
|
測序類型 |
PE150 |
1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量及其它質(zhì)控要求：
| 樣本類型 | 樣本質(zhì)控要求 |
| 細(xì)胞懸液 | > 10* 目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)（底限 10,000 個細(xì)胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 濃度 500-1,000 個細(xì)胞 /ul； | |
| 細(xì)胞間無粘連（成團(tuán)率 <5%）； | |
| 無大于 40um 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物； | |
| 不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 組織 | 0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4~5 塊。 |
4、保存運(yùn)輸：
（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。
（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。
圖 數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾
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圖 去除批次效應(yīng)
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圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群注釋
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圖 單細(xì)胞 RNA 測序樣本間的細(xì)胞構(gòu)成差異
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圖 單細(xì)胞 RNA 測序 Marker 基因分析
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圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序分析
圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序 GO 注釋
圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群的功能富集分析
圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群的功能富集在樣本間的差異
圖 單細(xì)胞 RNA 測序樣本間的功能差異分析
圖 細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)
1、胚胎發(fā)育
2、器官發(fā)育
3、干細(xì)胞分化
4、神經(jīng)科學(xué)
5、腫瘤微環(huán)境
6、用藥指導(dǎo)
7、病毒感染
[1] Ramskold D, Luo S, Wang YC, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30(8):777-782.
[2] Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 2013, 10(11):1096-8.
[3] Picelli S, Faridani OR, Björklund AK, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 2014, 9(1):171-81.
[4] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 2009, 6(5):377-382.
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