熒光定量PCR儀技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

劉向國 謝國明 (重慶醫(yī)科大 重慶市 400016)

摘 要 熒光定量PCR儀技術(shù)是一種新的核酸定量技術(shù)，該技木在PCR儀反應(yīng)系統(tǒng)中引人了熒光標(biāo)記探針，具有可實(shí)時監(jiān)測，高靈敏性，高特異性和高精確性的特點(diǎn)，極大地克服了原有PCR儀技術(shù)的不足，擴(kuò)大了PCR儀的應(yīng)用范圍。
關(guān)鍵詞 定量pcr；熒光；基因

Flu0rescence quantitative PCR and its application to m edicine
LIU Xiang-guo，XIE Guo-ming
(Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 40001 6)
Abstract Fluorescence probe is cited in the PCR instrument mentioned in this paper． As a new kind of nucleogen technology， fluorescence quantitative PCR has such exeellences as high sensibility，specificity and accuracy．W ith the application of the new technology，the deficiencies of the traditional one are conquered and the application field of the instru ment is extended．
Keywords quantitative PCR；fluorescence；gene

1 概述
熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)將熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)應(yīng)用于常規(guī)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀中，從而進(jìn)行定量檢測。FRET即是通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極一偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體發(fā)色團(tuán)，轉(zhuǎn)移效率與曲個發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例。與普通定量PCR相比，熒光定量pcr儀具有可實(shí)時監(jiān)測、準(zhǔn)確性高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，本文綜述目前國內(nèi)外幾種熒光定量PCR儀技術(shù)及應(yīng)用。
2 熒光定量PCR 方法
2．1 TagMan
TagMan技術(shù)是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能夠裂解雙鏈DNA5 端核苷酸，釋放出單個或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置換了的具有又樣結(jié)構(gòu)的單鏈DNA，水解作用發(fā)生于結(jié)合了置換部位的磷酸二酯鍵處�；�于Tag酶的這種活性，設(shè)汁合成一個能與PCR產(chǎn)物雜交的探針，該探針的5 端標(biāo)記一個熒光分子．3 端標(biāo)記另一個熒光分子。其中3 端熒光分子能夠吸收5 端熒光分子發(fā)出的熒光，因此，正常情況下該探針檢測不到3 端熒光分子的熒光信號，但當(dāng)溶液中有PCR 產(chǎn)物(模板)時，該針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Tag酶5 外切酶活性，將探針5 端連接的熒光分子從探
針上切割下來，破壞了兩熒光分子間的FRET，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。因此，根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的量。其主要不足是：

2．2 Molecular beacon
分子信標(biāo)技術(shù)(molecular beacon)也是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和淬滅分子，與Tag Man探針不同的是，該探針5 和3 末端自向形成8個堿基左右的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，于是溶液便產(chǎn)生了熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。該方法的特點(diǎn)是采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低 其不足之處是：(1)雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差；(2)探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜
近來，基于Molecular beacon的原理，人們對其進(jìn)行改進(jìn)，使用了一種發(fā)卡式引物(sunrise primer)．此法能將所有擴(kuò)增產(chǎn)物均標(biāo)記上熒光分子，因此熒光信號響應(yīng)快。但無法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是致命不足 為了克服不足，人們義對其進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)明了一種稱為蝎狀引物(scorpion primer)的熒光定饋pcr技術(shù)。該技術(shù)在引物與Molecular beacon探針之間連接一個間隔臂，使PCR延伸反應(yīng)時不能夠延伸至Molecular beacon分了 這樣，非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便無熒光信號，但當(dāng)有物異擴(kuò)增產(chǎn)物時， 即可與Molecular beacon進(jìn)行分了內(nèi)雜交， 產(chǎn)生熒光信號既解決了非特異問題，又保留了響應(yīng)快的特點(diǎn)。但仍存在雜交時， 探針不能完全與模板匹配及合成復(fù)雜的問題.
2．3 Amplisensor
Amplisensor是一種復(fù)合探針技術(shù)，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一種淬滅物。 探針長度不同，其中淬滅物標(biāo)記探針5 端多出7個堿基(GCGTCCC)。PCR擴(kuò)增前需將熒光物標(biāo)記探針與一個半套式PCR引物連接，PCR引物的5 應(yīng)有一段與長探針互補(bǔ)的序列． 以便連接酶將該引物與短探針連接。擴(kuò)增時該探針一引物復(fù)合物作為半套式引物摻入模板，從而釋放淬滅探針部分，破壞了熒光能量傳遞，產(chǎn)生熒光。熒光的強(qiáng)度與擴(kuò)增時加入的模板數(shù)成正比。該方法主要特點(diǎn)：(1)采用半套式PCR擴(kuò)增，提高了靈敏度，但無法區(qū)分引物二聚體形成產(chǎn)生的非特異擴(kuò)增信號，使定量準(zhǔn)確度受到影響；(2)每次PCR擴(kuò)增前，要先進(jìn)行Amplisensor的標(biāo)記，增加了操作步驟和檢測成本；(3)中間需加入半套式引物，增加了污染機(jī)會。
2．4 Lightcycler
Lightcycler是新近發(fā)展起來的一種定量pcr技術(shù)，該技術(shù)將熒光分子和淬滅分子分別標(biāo)記在兩個不同的探針上，形成發(fā)光探針和淬滅探針，發(fā)光探針的5 端與淬滅探針的3 端分別連接熒光分子。兩探針設(shè)計(jì)為可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交，雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此進(jìn)行定量分析。該方法淬滅效率高，但由于兩個探針結(jié)合于模板上，因此影響擴(kuò)增效率。此外，由于需合成兩個較長探針，合成成本較高。

3 在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
3．1 病原體測定
PCR技術(shù)的問世使病原體檢測能夠快速、方便地進(jìn)行。由于pcr技術(shù)假陽性率太高，只要有微量病原體存在就可得到陽性結(jié)果，這并不能作為診斷依據(jù)， 只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義。因此，對模板準(zhǔn)確定量顯得特別重要，應(yīng)用熒光技術(shù)PCR(FQ—PCR)就能夠快速、準(zhǔn)確地得到結(jié)果。對于解決免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題，判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)，以及抗體檢測不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染時，均可利用FQ—PCR進(jìn)行確定。
一些研究資料表明，病原體感染后的發(fā)病時間，病情輕重及預(yù)后往往與病原體數(shù)量相關(guān)。如HIV感染后，潛伏期長短、臨床癥狀輕重與血液中病毒量顯著相關(guān)，甚至可根據(jù)HIV的量比較準(zhǔn)確地預(yù)測發(fā)病時I 。在研究其他病毒感染性疾病是否有類似情況，病原體的致畸和致突變作用是否與病原體的量等有關(guān)問題時，也可利用FQ—PCR來闡明。另據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素對肝炎病毒高拷貝者不敏感，對低拷貝者敏感。因此利用FQ—PCR對某些病毒的定量分析可指導(dǎo)臨床用藥和制定治療方案。
3.2 腫瘤研究
盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明，但相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已得到普遍承認(rèn)。癌基因的表達(dá)增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就可出現(xiàn)，F(xiàn)Q—PCR 不但能有效地檢測基因的突變，而且能準(zhǔn)確測定表達(dá)量，據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。某些癌基因的遺傳學(xué)變化的檢測幾乎達(dá)到確診腫瘤的程度。例如，CD 基因的異常拼接表達(dá)，幾乎只有出現(xiàn)于某些泌系腫瘤。對于有慢性骨髓性白血病都可檢測到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR／ABL融合基因形成，F(xiàn)Q—pcr技術(shù)不但可通過檢測BCR／ABL融合基因的表達(dá)而進(jìn)行腫瘤診斷，還可檢測治療中和治療后
微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果
和估計(jì)復(fù)發(fā)的危險性的依據(jù)。
3．3 其他方面
在基因表達(dá)研究中， 由于FQ—CPR的應(yīng)用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法， 如Northem印跡、RT—PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。在免疫組分析中，對免疫T細(xì)胞群體V—p組織進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段。利用FQ—PCR技術(shù)進(jìn)行分析，克服了原來分析方法如流式細(xì)胞法、競爭性pcr技術(shù)等操作復(fù)雜，準(zhǔn)確性低，污染嚴(yán)重的缺點(diǎn)。
4 結(jié)語
綜上所述，F(xiàn)Q—PCR作為一種核酸定量技術(shù)，在以前的pcr技術(shù)上得到進(jìn)一步發(fā)展，大大降低了假陽性率，工作效率高，結(jié)果重現(xiàn)性好，且不必使用對人體有害的染色劑。FQ—PCR應(yīng)用較多且較成熟主要是在病原體檢測方面，其優(yōu)越性在此也得以充分體現(xiàn)。因此將其應(yīng)用于臨床具有很大潛力。在腫瘤、遺傳病研究，尤其
是基因表達(dá)方面的研究，該技術(shù)應(yīng)用還較少，在這方面加強(qiáng)研究應(yīng)用，將會有廣闊的前景。將生物基因芯片技術(shù)與FQ—PCR技術(shù)結(jié)合，有助于pcr技術(shù)的進(jìn)一步完善，推動該技術(shù)的發(fā)展、應(yīng)用。

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