如何選擇高效液相色譜柱及維護(hù)與保養(yǎng)
現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。
1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。
由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。
常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點是在PH值為1～14均可使用。相對與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。現(xiàn)在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
三、其他無機(jī)填料
其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在PH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。
怎樣選擇填料粒度
目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。
一、如何保證良好的柱性能與柱壽命
◆ 認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書；
◆ 使用填充良好的色譜柱；
◆ 盡量減少壓力波動，避免機(jī)械及熱沖擊；
◆ 使用保護(hù)柱及在線過濾器；
◆ 經(jīng)常以強溶劑沖洗色譜柱；
◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強保留成分；
◆ 用穩(wěn)定的固定相（C18最穩(wěn)定）；
◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機(jī)緩沖溶液；
◆ 色譜柱使用溫度最好小于40℃；
◆ 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0；
◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；
◆ 流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；
◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動相保存（乙晴最好）。
HPLC固定相及應(yīng)用范圍
名稱 別名 功能基團(tuán) 正相 反相 離子對 應(yīng)用 |
Silica -OH √ 非極性和中等極性以及非離子性有機(jī)化合物。 |
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留最弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物. |
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分離肽和蛋白質(zhì)，保留時間比C8和C18短。 |
MOS C8， -C8H17 √ √ 中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，Octyl 極性藥族化合物和環(huán)境樣品。 |
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基鍵合相中對中等極性化合物保留最強。廣泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品. |
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 對極性化合物有獨特的選擇性，適合應(yīng)用于正相(propyl 分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與 C8和Nitrile) C18不同，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)用廣泛。 |
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子 |
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物 |
Diol -(CH2)2O √ √ 反相時，分離肽和蛋白質(zhì)。正相時，與硅選擇CH2(CH2OH)2 性 相似,但極性較弱。 |
SCX 強陽離子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有機(jī)堿交換 |
SAX 強陰離子 -(CH2)3N+(CH3)3 有機(jī)酸，核苷和核苷酸交換 |
二、如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題
1.保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析
問題 原因 表現(xiàn) |
不同色譜柱間差異 填料、鍵合相不同 保留因子（k），分離因子（α） |
柱外效應(yīng) 系統(tǒng)差異，進(jìn)樣量大、 柱效（N）進(jìn)樣閥與 色譜柱之間、色譜柱與檢測器之間管路太長、檢測器流通池體積大、接頭死體積大等。 |
分離效果變差 流動相組分改變 保留因子（k），柱效變化很小流速改變 保留因子（k），分離因子（α）溫度改變 保留因子（k），柱效變化很小 |
柱平衡慢 重新平衡時間不夠 保留因子（k），柱效變化很小 |
柱超載 樣品量太大 保留因子（k），柱效（N） |
2.造成色譜峰（不對稱）拖尾的原因
1.色譜柱本身填裝問題，篩板堵塞或填料塌陷；
2.柱頭有污染；
3樣品超載；
4樣品溶劑不合適；
5.柱外效應(yīng)；
6化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；
7緩沖容量不足或不合適；
8重金屬污染。
3.如何解決峰形拖尾的問題
A．與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題
1．流動相中，加入30mM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未
知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3．降低進(jìn)樣量至<1ug。
B．與色譜柱有關(guān)的拖尾問題
1．如柱頭處有強保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲
醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗，正向柱可用甲醇沖洗。
2．使用保護(hù)柱
C．與HPLC 系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬
1．進(jìn)樣體積過大，（通常≤25uL）；
2．進(jìn)樣閥與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大（最佳連接管應(yīng)<20cm，內(nèi)徑為0.007″）；
3．檢測器流通池的體積過大。
4．如何儲存色譜柱
1．防止緩沖溶液和水溶液流動相產(chǎn)生微生物，做到流動相用多少配多少，或在水流動相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌成長（一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動相中加20%的有機(jī)改性劑，也可抑制微生物生長，有機(jī)改性劑還有助于流動相脫氣。
2．盡可能將色譜柱貯存于100%有機(jī)溶劑（乙晴最好）中，避免在緩沖溶液中保存。
3．使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機(jī)溶劑流動相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑儲存。
4．避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。
5．將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。
如何選擇保護(hù)柱
怎樣選擇保護(hù)柱，但又不能影響分離分析？這是色譜工作者經(jīng)常提出的一個問題。通常，在選擇保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對于大部分分析工作者來說，一只1cm長的保護(hù)柱，那么就應(yīng)選擇2cm或3cm長的保護(hù)柱。保護(hù)柱越長，自然所裝填的色譜填料就越多，則其越能避免污染物進(jìn)入分析色譜柱的機(jī)會。當(dāng)然，隨著保護(hù)柱的長度加長，樣品的保留時間會比使用短保護(hù)柱長。一般來說，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。保護(hù)柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過程很簡單方便，而且可以在實驗室中進(jìn)行干裝。但是，其最大的缺點是不經(jīng)濟(jì)，特別是針對中國的具體情況，一次性使用相對費用較高。另外，薄膜裝填法的保護(hù)柱所裝填的色譜填料有限，只能提供有限的保護(hù)作用；不過也因為所裝填的色譜料較少，保護(hù)柱的長度也較短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。另一種保護(hù)柱結(jié)構(gòu)其實質(zhì)是縮短了的色譜分析拄，設(shè)計方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設(shè)計是由色譜的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結(jié)構(gòu)設(shè)計可在任何時候有色譜工作者來安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據(jù)樣品的相關(guān)情況選擇不同的保護(hù)柱長度。手上緊即可。另外從保護(hù)柱結(jié)構(gòu)又分為是否可以更換保護(hù)柱柱芯�？梢越档捅Ｗo(hù)柱的使用成本。大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料選擇保護(hù)柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據(jù)實際的分析工作，也可不必與分析色譜柱的填料完全相匹配。
對于選擇保護(hù)柱的原則是：在滿足分析分離要求的前提條件下，盡可能的選擇較短的保護(hù)柱結(jié)構(gòu)，盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。
