腸道病毒EV71 TaqMan熒光定量RT PCR法快速檢測(cè)

據(jù)中央電視臺(tái)報(bào)道，2008年4月29日上午8：30，安徽省衛(wèi)生部門(mén)發(fā)布了當(dāng)?shù)貎和�感染腸道病毒EV71的最新情況。據(jù)悉，截至28日，累計(jì)報(bào)告了腸道病毒EV71感染病例1520例，死亡沒(méi)有增加，仍是20例。
病毒如虎，時(shí)不我待，特推薦此文，借助同道一臂之力！

【摘要】 目的 建立一種特異、靈敏、快速的熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)腸道病毒核酸，應(yīng)用于暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)。方法 根據(jù)GenBank登錄的腸道病毒基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在腸道病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；對(duì)熒光RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證方法的特異性和靈敏度。同時(shí)對(duì)疑似腸道病毒感染者的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 該方法對(duì)腸道病毒的檢測(cè)有高度的特異性，可檢出脊髓灰質(zhì)炎、柯薩奇和埃可等腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙型腦炎等病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。檢測(cè)的靈敏度達(dá)0．1病毒效價(jià)滴定(TCID50)；可直接從疑似腸道病毒感染者的腦脊液、皰疹液和糞便等標(biāo)本中檢測(cè)腸道病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3h左右。結(jié)論 所建立的TaqMan熒光定量RT�睵CR是一種快速檢測(cè)腸道病毒特異、敏感的方法，適用于由腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。

【關(guān)鍵詞】 熒光定量RT�睵CR；TaqMan探針；腸道病毒；臨床標(biāo)本
腸道病毒(EV)屬于小RNA病毒科，根據(jù)血清學(xué)可以分為脊灰病毒、柯薩奇、�？刹《竞湍c道病毒68～71型，共67個(gè)血清型。腸道病毒可引發(fā)眾多疾病，并可暴發(fā)流行，導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。浙江省近幾年由腸道病毒引起的無(wú)菌性腦炎〔1，2〕、手足口病〔3〕、急性出血性結(jié)膜炎和新生兒急性心肌炎等暴發(fā)疫情頻頻發(fā)生。為了迅速查明病因，及時(shí)采取控制措施，亟需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷，但腸道病毒傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是病毒分離和中和法定型，不僅繁瑣費(fèi)時(shí)，而且無(wú)法對(duì)所有的血清型進(jìn)行鑒定，更不能對(duì)一些抗原變異株或新型別毒株進(jìn)行鑒定。本研究建立的腸道病毒熒光定量RT�睵CR方法，為腸道病毒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)提供了有效的分子生物學(xué)檢測(cè)手段。

1.材料與方法:

1.1 病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床標(biāo)本 脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin Ⅰ～Ⅲ型疫苗株(北京生物制品研究所)；柯薩奇、�？珊湍c道病毒70～71型等標(biāo)準(zhǔn)株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙型腦炎等毒株(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)。臨床樣本來(lái)源于浙江省近幾年各地報(bào)告的疑似腸道病毒感染疫情如無(wú)菌性腦炎、手足口病、疑似脊髓灰質(zhì)炎和急性出血性結(jié)膜炎等患者的腦脊液、皰疹液、糞便和眼拭子等，樣本采集后常規(guī)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 引物與探針 從GenBank上下載不同年份和地區(qū)的腸道病毒基因序列，用生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性比較，在5′非編碼保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，序列為EV�睩：5′�睠TGYRGCGGAACCGACTAC��3′；EV�睷：5′�睞TTGTCACCATAAGCAGCCA��3′；EV�睵robe：5′FAM�睺TGGGTGTCCGTGTTT�睲GB��3′。引物和探針委托上�；�康生物工程有限公司合成。

1.3 病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取 以Sabin Ⅲ型疫苗株為標(biāo)準(zhǔn)毒株，用人橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)進(jìn)行病毒效價(jià)滴定(107，5TCID50／ml)后作為參考株，將其稀釋TCID50分別為1000，100，10，1，0��1，0��01于每個(gè)反應(yīng)管。病毒RNA的提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)(德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit)。

1.4 熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 試驗(yàn)在以相同濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從100～900μmol／μl，探針濃度從50～300μmol／μl,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光RT-PCR反應(yīng)的最低熒光閾值(Ct值)和最高熒光強(qiáng)度增加值(△Rn)選擇最佳引物和探針濃度。試劑盒采用(AKARA公司)熒光RT-PCR Kit，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 RT�睵CR反應(yīng) 腸道病毒RT-PCR通用引物參照文獻(xiàn)〔4〕，EV1：5′�睞AGCACTTCTGTTTCCC��3′(166-182)，EV2：5′�睞TTCAGGGGCCGGAGGA��3′(447��463)，擴(kuò)增片斷297bp。采用RT�睵CR試劑盒(美國(guó)Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μl。其中5×RT�睵CR緩沖液4μl，4種脫氧核苷酸(dNTP)混合物(10mmol／L)1��6μl二硫疏糖醇(DTT)(100mmol/L)1��0μl,RNase抑制劑(5u/μl)0��4μl，20μmol／L上游引物與下游引物各0.��5 μl，Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物(5u／μl)0��4μl，模板RNA 10μl，最后用焦碳酸二乙脂(DEPC)水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為50℃ 30min，94℃ 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和變性，然后94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min進(jìn)行擴(kuò)增，35個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)入68℃ 7min，取8μl產(chǎn)物電泳后判斷有無(wú)特異性條帶。

1.6 熒光RT�睵CR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 選擇腸道病毒：脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型，柯薩奇病毒A16,A24，B1，B3，B5,�？刹《�7，20，30型和腸道病毒71型，以及選擇容易引起腦炎等癥狀的非腸道病毒，麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙腦、登革熱病毒等，對(duì)上述2組病毒分別提取核酸，用腸道病毒熒光RT�睵CR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的特異性。對(duì)已標(biāo)定TCID50的腸道病毒Sab in Ⅲ型(107，5TCID50／ml)稀釋后分別提取RNA，平行進(jìn)行熒光RT�睵CR與RT�睵CR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對(duì)每一個(gè)濃度的病毒稀釋液作5次重復(fù)檢測(cè)，得到的Ct值采用stata8��0軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 熒光RT�睵CR法的Ct值采用Stata8��0軟件計(jì)算其±s

2 結(jié)果

2.1 熒光RT�睵CR反應(yīng)體系及條件 采用一步法熒光RT�睵CR試劑盒，總反應(yīng)體系為25μl。矩陣法優(yōu)選后引物最佳濃度均為0��64μmol/L，探針最佳濃度為0.30μmol／L，模板RNA 10μ1，最后用DEPC水補(bǔ)至25μl。用MJ Research Option 2熒光檢測(cè)系統(tǒng)或Roche Lightcycle熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為：45℃ 30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2?min，以93℃ 15s，60℃ 1min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，可獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。

2.2 特異性試驗(yàn) 本研究建立的熒光RT�睵CR方法對(duì)腸道病毒具有較好的特異性，可檢測(cè)PVl-3，Cox A16、A24、Bl、B3、B5，ECH07、20、30，EV70～71型等不同群的腸道病毒，而與腮腺炎、乙腦、登革熱、麻疹、風(fēng)疹病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.3 敏感性試驗(yàn) 對(duì)腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株，采用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定(107，5TCID50/ml)，然后稀釋成1000，100，10，1，0.1，0.01 TCID50，提取病毒RNA，分別用熒光RT-PCR與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果熒光RT-PCR方法檢測(cè)敏感性達(dá)到0.1 TCID50，比常規(guī)RT-PCR方法的靈敏度1.0 TCID50高10倍左右。
A～E：1000，100，10，1，0.1 TCID50
圖1 熒光PT-PCR法檢測(cè)腸道病毒的靈敏度（略）

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株按10倍梯度稀釋成4個(gè)不同的濃度，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作5個(gè)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.23～0.65之間，具有較好的重復(fù)性。
表1 熒光RT-PCR法檢測(cè)腸道病毒核酸的重復(fù)性試驗(yàn)（略）

2.5 樣本的檢測(cè) 從浙江省各地報(bào)告的病毒性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎和急性心肌炎等等疑似腸道病毒感染疫情患者的腦脊液23份、糞便20份、皰疹液8份和眼拭子7份等臨床樣本中直接提取病毒RNA，用建立的熒光RT-PCR方法檢測(cè)腸道病毒核酸。結(jié)果顯示，58份樣本中腸道病毒核酸陽(yáng)性的有32份。同時(shí)對(duì)上述樣本采用RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行腸道病毒分離，結(jié)果病毒分離陽(yáng)性的24份，其余8份熒光RT�睵CR方法陽(yáng)性而病毒分離陰性的樣本，采用腸道病毒通用引物直接從樣本中提取病毒核酸后進(jìn)行1次或2次RT�睵CR擴(kuò)增相應(yīng)片段、測(cè)序和BLAST比對(duì)，最終確定為腸道病毒。

3 討論
腸道病毒是最常見(jiàn)感染人類(lèi)的病毒，可導(dǎo)致多種疾病，臨床表現(xiàn)多樣，近幾年由腸道病毒引起的暴發(fā)疫情時(shí)有發(fā)生〔1-3,5〕。對(duì)該類(lèi)疫情盡早作出實(shí)驗(yàn)室確診是及時(shí)采取防控措施與對(duì)癥治療的關(guān)鍵。近幾年發(fā)展起來(lái)的以特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)，而且較常規(guī)RT�睵CR技術(shù)，無(wú)診從敏感性、特異性與速度上都更具有優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然它對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)也提出了更高的要求〔6-8〕。我們從美國(guó)的NCBI與日本的DDBJ基因庫(kù)上下載了近20年來(lái)世界各地的腸道病毒株，對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，在腸道病毒5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)若干對(duì)引物與Taqman探針，對(duì)該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從中篩選出最佳的引物和探針，并對(duì)熒光RT-PC方法進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床樣本的檢測(cè)比較，該方法具有高特異性，能檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型、柯薩奇病毒Bl、B3、B5，�？刹《�7、20、30型及新型腸道病毒70～71型等多個(gè)血清型別的腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙腦、登革熱病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RT�睵CR和病毒分離法更敏感、快速和簡(jiǎn)便。通常腸道病毒的RT�睵CR檢測(cè)敏感度在1.0 TCID50左右，從病毒核酸提取、RT�睵CR反應(yīng)與電泳，整個(gè)過(guò)程大約需6～7h左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測(cè)，僅需3h左右，能同時(shí)完成多個(gè)疑似患者臨床樣本的高通量檢測(cè)，敏感度達(dá)0 . 1 TCID50，比普通PCR的靈敏度高10倍左右，可直接從無(wú)菌性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎患者的腦脊液、糞便、皰疹液和眼拭子等臨床樣本中檢測(cè)腸道病毒核酸，而且核酸陽(yáng)性的樣本被腸道病毒分離和基因測(cè)序的結(jié)果得到進(jìn)一步的證實(shí)。我們用建立的新方法，對(duì)近幾年我省疑似腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結(jié)果。

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