細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)

細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)（一）
1 冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi)？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于-20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘＊) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。＊-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無(wú)法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？
定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

25 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

26 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于-80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)（二）
無(wú)菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70% ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類(lèi)或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。 5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類(lèi)?
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌制品。
1.2. TC 級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類(lèi)有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。 2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃水槽中溫?zé)帷?
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10% 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH 之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。 3.2. 材料：
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無(wú)菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱(chēng)取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類(lèi)而異，表一)溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合�；旌笕芤褐畃H應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH 會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類(lèi)、日期、瓶號(hào)等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。 4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸? 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。

細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)（三）
如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？ 用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 1. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 2. 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。 5. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 6. 重復(fù)步驟4。 7. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)（四）
1.如何選用培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)�？傊�，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。

2.為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？
它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？
培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？
用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200-2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞�；罴�(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3代。
5)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6)重復(fù)步驟4。
7)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？
Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗(yàn)生物化學(xué)檢測(cè) 激素的檢測(cè)血紅蛋白檢測(cè)Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)

11.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？
二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

12.制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？
是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中�；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒(méi)有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）。（注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積）。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來(lái)可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？
如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過(guò)程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）

15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？
如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。

16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎？
對(duì)于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室溫下(25℃)配制的

17.Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。

18. 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少？
生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系，在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

19. High Five細(xì)胞有任何其它名稱(chēng)嗎？
High Five細(xì)胞也被稱(chēng)為T(mén)richoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？
High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five細(xì)胞用多大的密度凍存？
3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對(duì)我的細(xì)胞有害嗎？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。

23.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？
我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過(guò)使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：1)去除培養(yǎng)基。2) 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。5) 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）6) 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？ 為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。 25.如何評(píng)估ES細(xì)胞合格的胎牛血清？ 使用D3 ES細(xì)胞。這是一個(gè)對(duì)于胎牛血清中生長(zhǎng)促進(jìn)、生長(zhǎng)抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。相關(guān)生長(zhǎng)效率分析：當(dāng)ES細(xì)胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)開(kāi)始和支持ES細(xì)胞克隆的能力。細(xì)胞毒分析：當(dāng)以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)ES細(xì)胞和feeder細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：檢測(cè)胎牛血清支持未分化ES細(xì)胞克隆的能力。通過(guò)堿性磷酸酶活性評(píng)估分化程度。未分化的ES細(xì)胞小顏色深紅粉紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。所有的分析在沒(méi)有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會(huì)掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問(wèn)題。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來(lái)保持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。）經(jīng)過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約8批中有1批可以用來(lái)培養(yǎng)ES細(xì)胞。

26.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？
通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候記數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò)95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。