PCR應用中存在的問題

開展 PCR 應具有一定的條件。需要一個正規(guī)的 pCR 實驗室，采集標本、核酸提取、擴增及產物分析應在不同的房間進行；需有嚴密的防污染措施、假陽性和假陰性結果的質控等。實驗者應具有一定的分子生物學理論知識及實驗技能，能夠及時發(fā)現(xiàn)和糾正實驗中的問題。目前，我國在 PCR 應用中尤其是在臨床診斷中存在問題較多，主要表現(xiàn)為： PCR 試劑的考核、審查工作薄弱，許多單位實驗條件不符合要求，部分操作人員的理論和實驗知識水平較低。 PCR 的應用范圍過寬等，因此造成 PCR 實驗結果的可靠性差，出現(xiàn)較多的假陽性、假陰性結果。
一、假陽性：
　　實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現(xiàn)。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結果，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、 DNA 抽提儀器、試劑及任何與擴增產物接觸的東西。預防措施：(1)工作區(qū)隔離。(2)改進實驗操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化，如后加陽性對照等。
　　交叉污染的處理方法： 交叉污染指擴增產物對將要擴增的樣品或反應管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產物污染標本或反應管即可出現(xiàn)假陽性。交叉污染的處理方法包括 [1] ：
1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應管內容物以破壞污染的 PCR 產物。一般選用波長 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ）
2 ． PCR 實驗中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的 PCR 產物，而不降解基困組 DNA 模板，然后熱滅活此酶，再進行擴增反應（ Gene ， 1990 ， 93 ： 125 ）。美國 PE 公司提供此類試劑盒（ PCR carry-over preventionkit 。
3 ．在 PCR 反應前加入一種光化學試劑，反應完成后激活該試劑，光化學試劑可交聯(lián) DNA 鏈，使之不能再擴增（ Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 ： 99 ）。
二、假陰性：
　　如果實驗中設置的陽性對照未能擴增成陽性結果，提示本次實驗中可能有假陰性結果。但這里應注意，許多國產 PCR 試劑盒中陽性對照采用質粒 DNA ，和標本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽性，標本檢測中還可能有假陰性。
　　造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過程不當。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑，如尿素、 DMSO 、 SDS 等物質，可抑制 Taq 酶活性， DNA 樣品中的蛋白質和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性，尤其是含有較多膿液或分泌物的標本，其中雖有待查菌，但卻因標本處理不當而出現(xiàn)假陰性 [2] 。
　　設置內對照是判斷假陰性較好的指示系統(tǒng)。在每一反應管中加入內對照，若內對照未能擴增出來，說明該反應管的結果可能有問題。
三、PCR產物的鑒定
　　PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長度是否為預期的長度，但只有通過雜交試驗或序列分析等才能判斷其特異性。嚴格說來， PCR 產物均應通過實驗證實其特異性。在我國一些科研論文和臨床檢測中缺乏這一環(huán)節(jié)。
　　綜上所述， PCR 具有其優(yōu)點，但也有不足之處，它是一種很好的科研手段，但作為常規(guī)診斷方法尚需進一步改進和提高 [9] 。目前的關鍵問題是如何正確應用 PCR 。雖然 PCR 尚未在包括美國等發(fā)達國家作為常規(guī)診斷方法，但如果具備開展 PCR 需要的條件， PCR 是可作為輔助診斷手段使用的。目前，只有針對 PCR 應用中存在的問題，采取措施，正確應用 PCR ，才能使這一技術在科研和臨床工作中發(fā)揮應有的作用。
　
參考文獻
[1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992, 252:1643.
[2] 葉順章，聚合酶鏈反應在性病診斷中的應用，中華皮膚科雜志， 1996 ， 29/p>
[3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr, 1995,53(4):155