PCR產(chǎn)物克隆

克隆方法：
1. 平端連接
　　通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3''突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，�？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3''末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。
2. 粘端連接
　 引物中設(shè)計入限制酶位點：由于PCR引物的5''末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5''末端設(shè)計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5''端多合成3-4個堿基以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數(shù)個核苷酸創(chuàng)造出一個限制性內(nèi)切酶位點。鑒于PCR引物的3''末端序列的互補性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5''端改變1個或幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優(yōu)于5''加端法。對于特定DNA段的克隆，此方法較為經(jīng)濟、實用。但對于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5''加端法更為適宜。 T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端：如PCR兩引物的5''末端是A或T，則可在其5''端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3''→5''外切酶活性而消去3''末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。此DNA段直接與用AccI和XmaI切開的載體進(jìn)行連接。這種方法只需在PCR引物的5''端加2-4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。
3. T－vector法
　　TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3''末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3''端突出一個胸苷的質(zhì)粒DNA來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將predscript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化predscript的兩個3''末端各加一處胸苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3''末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3''末端加上一個胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個3''末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3''末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5''末端連接，僅5''末端可與PCR產(chǎn)物的3''末端形成磷酸二脂鍵。
4. 共環(huán)消解法
　　最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化連接反應(yīng)，使5''端帶有限制酶切位點的擴增DNA段連接成共環(huán)結(jié)構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA段。對于對稱性限制酶位點，只需在引物的5''末端加上一段識別序列，因為在串接成共環(huán)后能糾正線性DNA的限制酶切位點難以切開的缺點，且可用于雙限制酶切位點的設(shè)計，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切點得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。
　　無連接酶亞克隆法(A)無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5''末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質(zhì)粒兩端分別互補的堿基。兩引物的3''端約20-25個核苷酸分別與待擴增DNA兩翼互補，5''端各有約24個核苷酸分別與線性化質(zhì)粒的3''端相同的附加序列。由于線性化質(zhì)粒的3''端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5''附加序列與引物3''端定向雜交。
　　由此物a和b產(chǎn)生的兩端有附加序列的PCR產(chǎn)物與未反應(yīng)引物分離后，分別加入兩只含有線性化質(zhì)粒的反應(yīng)管中進(jìn)行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5''端附加序列內(nèi)測的質(zhì)粒（+）鏈互補。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5''附加序列內(nèi)側(cè)的質(zhì)粒（-）鏈互補。
　　第二次PCR的第一循環(huán)中，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒均變性與復(fù)性。除自身復(fù)性產(chǎn)物（這種復(fù)性產(chǎn)物不被擴增）外，PCR產(chǎn)物與質(zhì)�？赏ㄟ^各自3''端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3''端互為此物沿各自互補鏈延伸，結(jié)果可產(chǎn)生PCR片段與線性質(zhì)粒的"連接"。然后兩管中PCR擴增各進(jìn)行15-20個循環(huán)。這便可產(chǎn)生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質(zhì)粒。 第二次PCR后將第1管與第2管反應(yīng)液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應(yīng)管中的單鏈DNA可以復(fù)性或幾種不同的產(chǎn)物，除各自本身復(fù)性產(chǎn)物外，管1產(chǎn)物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5''或3''懸端，這種長的5''或3''懸端相互互補，在低DNA濃度時可復(fù)性產(chǎn)生環(huán)化DNA。
　　盡管這種環(huán)化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉(zhuǎn)化受體大腸直桿菌。一旦進(jìn)入體內(nèi)，兩個缺口便共價連接，修復(fù)的質(zhì)粒即可復(fù)制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。
　　這種方法同樣適于復(fù)雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5''附加序列不應(yīng)太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化率。用LFS法已成功地克隆了長達(dá)1.7kb的基因片段。這種方法的優(yōu)點是：①可用于常規(guī)方法無法進(jìn)行亞克隆的片段；②適于任何PCR產(chǎn)物和任何質(zhì)粒；③可亞克隆特殊目的（如含點突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構(gòu)建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達(dá)片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內(nèi)完成，較常規(guī)方法可靠，不需DNA連接酶。