PCR基因芯片上熒光PCR反應的研究

郝麟1） 朱平1）＊ 于曉梅2） 張大成2） 趙新生3） 歐陽賤華3

（1）北京大學第一醫(yī)院 北京 100034； 2）北京大學微電子學研究所 北京100871； 3）北京大學化學與分子工程學院 北京100871）

目的:
我們設計一種含有大量微反應池的PCR基因芯片，能對基因的重排，突變和缺失等基因變異進行檢測。PCR基因芯片的關鍵問題是如何檢測出來在微反應池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。本文應用一些臨床病例的實例標本，觀察能否在基因芯片上進行不同的熒光摻入PCR反應并根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

方法：制作以硅片為材料的PCR基因芯片。利用健康外周血，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細胞貧（XLSA）家系成員6人外周血DNA做PCR-SSCP，并測序確定。設計檢測此點突變的Taqman探針進行熒光PCR反應，在芯片上進行同樣的反應，與上述反應結果進行對照。利用4步位點特異PCR結合SYBR熒光染料初篩HLAA2，并在芯片上進行同樣的反應，與上述反應結果進行對照。

結果：設計并制作了有192個微反應池以硅片為材料的PCR基因芯片。PCR-SSCP分析與測序確定X連鎖遺傳性鐵幼粒細胞貧血家系兩患者的ALAS2基因第5外顯子有G514A點突變，母親、外祖母為雜合子攜帶者。設計Taqman探針對此家系中六位成員DNA與二份正常男性臍血DNA檢測與預期結果相符。將上述結果中同樣的樣本移入芯片進行PCR反應，結果與常規(guī)熒光PCR反應的結果一致。SYBR熒光染料PCR反應與芯片上SYBR熒光染料PCR反應的結果與預期完全相符。

結論：利用TaqMan探針與SYBR
Green熒光染料可以在PCR基因芯片上順利進行PCR反應，根據(jù)基因芯片上熒光的變化檢測出點突變與單核苷酸多態(tài)性。為基因芯片的臨床應用打下了基礎。

關鍵詞： PCR基因芯片；熒光PCR反應；Taqman探針；熒光染料；

基因芯片技術具有快速多樣、微型化和自動化[1～4]等特點在生物醫(yī)學領域廣泛的應用。但由于其基本原理是基于核酸雜交技術，有著內(nèi)在的缺陷[5-6]，實驗的敏感性和重復性都存在一定問題。核酸雜交較適合于檢測基因的表達，不易檢測基因組DNA的基因的重排，突變和缺失。而大多數(shù)腫瘤性疾病和一些遺傳變異和表型的改變與后者有關。為了解決上述問題，我們將芯片技術與熒光PCR技術相結合，設立設計一種含有大量微反應池的PCR基因芯片，以期能快速、準確的對基因的重排，突變和缺失等基因變異進行檢測。常規(guī)PCR反應產(chǎn)物的檢測是電泳后觀察獲得基因片段的大小，PCR基因芯片的關鍵問題是如何檢測出來在微反應池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。本文應用一些臨床病例的實例標本，觀察能否在基因芯片上進行不同的熒光PCR反應，如何根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

1 病例、材料與方法

1.1 基因組DNA標本
健康成年人外周血DNA，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細胞貧血（XLSA）家系成員6人外周血DNA均獲自北京大學第一醫(yī)院，均簽署知情同意書。XLSA家系中患者為兄弟兩個，年齡分別為8、7歲，都在嬰兒時即發(fā)現(xiàn)貧血。家中有一個健康的姐姐，在兩兄弟出生前，母親曾有多次男胎自然流產(chǎn)史。成熟紅細胞形態(tài)呈典型的小細胞低色素性貧血，骨髓鐵染色可見大量環(huán)形鐵粒幼細胞。臨床初步診斷遺傳性鐵粒幼細胞貧血。

1.2 PCR基因芯片的設計與制作［7］
PCR基因芯片上制備大量微反應室，可以同時進行不同的PCR反應。采用單拋525mm厚硅片作為襯底材料。硅片常規(guī)清洗后，在10-50°C下生長800nm厚的濕氧熱氧化層，作為第一層掩膜層。然后150nm厚的Si3N4低壓化學氣相淀積（LPCVD）在硅片表面，形成第二層掩膜。第一次光刻，RIE刻蝕反應室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反應室的圖形，RIE和BHF刻蝕反應室表面的SiO2。KOH腐蝕反應室的硅至150 um，此時流道上的硅由于有足夠厚的SiO2作為保護層，沒有開始腐蝕。腐蝕掉流道上的SiO2，同時進行反應室及流道上繼續(xù)SiO2的腐蝕，KOH腐蝕的速度為1um／min，芯片進行熱氧化生長300 um SiO2，以增強其表面的親水性，保證反應液可以在芯片內(nèi)順利流動。芯片通過PVC聚合物壓合封閉。

1.3 PCR基因芯片上應用Taqman熒光探針
1.3.1 PCR擴增XLSA家系ALAS2基因第五外顯子并且獲得基因片段
經(jīng)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST查詢ALAS2基因的全長序列。應用Primer3.0軟件設計第五外顯子引物：上游引物: 5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物: 5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃ 3分鐘，然后94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 1分鐘共30個循環(huán)，72℃ 延伸5分鐘條件下進行PCR反應。取0.5EP管，加入7ulPCR產(chǎn)物及3ulSSCP上樣緩沖液，96℃變性10分鐘。10％SSCP－聚丙酰胺凝膠及銀染色。PCR 產(chǎn)物交上海博亞公司直接測序。

1.3.2 PCR-SSCP方法分析按照我室常規(guī)進行。

1.3.3 Taqman熒光探針 以發(fā)現(xiàn)的ALAS2基因第五外顯子點突變?yōu)橹行脑O計，序列如下： 5’ （熒光集團）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC- TAMRA（淬滅集團） 3’，設計Taqman熒光PCR反應的上下游引物。序列如下：上游引物:5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’，下游引物:5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’

1.3.4 常規(guī)實時定量PCR檢測ALAS2基因第五外顯子基因突變 在GeneAmp ®SDS 5700熒光PCR儀上進行，反應條件50℃0C 2分鐘，94℃ 10分鐘，然后94℃ 30秒，60℃ 30秒共40個循環(huán)

1.3.5 PCR基因芯片上進行PCR反應
用0.5ml清潔醫(yī)用注射器緩慢吸取Taqman熒光PCR反應液。刺破芯片表面PVC封膜，沿加樣孔緩慢將反應液加入，用透明膠帶封住加樣孔。將芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR儀，行PCR反應，探索不同反應條件。

1.3.6 PCR基因芯片上的PCR產(chǎn)物檢測 在共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw 1000)上檢測熒光。將芯片置于顯微鏡的載物臺上，在普通光源照明下，調(diào)節(jié)載物臺的垂直位置，使待探測的芯片上表面位于20X物鏡的焦平面上。再調(diào)節(jié)載物臺的水平位置，使反應池位于目鏡視野的中心。激發(fā)光源為氬離子激光器的488 nm線，檢測方式是背反式。
1.4 PCR基因芯片上應用SYBR Green熒光染料
1.4.1 普通PCR反應檢測20例正常人HLA-A2與非A2 應用4步位點特異性PCR反應初篩正常人HLAA2與非A2，4步反應引物如下(表1)
［8］：PCR反應條件按照本室常規(guī)。
表1檢測HLAA2與非A2 SCP反應引物


1.4.2 用SYBR Green熒光染料做常規(guī)實時定量PCR 在GeneAmp ®SDS 5700熒光PCR儀檢測進行PCR反應初篩HLAA2與非A2，與普通PCR做對照。SYBR Green熒光PCR反應條件: 94℃ 3分鐘，然后94℃ 1分鐘、退火溫度1分鐘、72℃ 1分鐘共30個循環(huán)，72℃ 延伸5分鐘。第一步反應的退火溫度為63℃,第二步、第三步反應的退火溫度為65℃、第四步反應的退火溫度為64℃。
.1.4.3 PCR芯片上進行SYBR Green熒光PCR反應 PCR反應法同Taqman熒光PCR，探索不同反應條件。
.1.4.4 在共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw 1000)上檢測熒光（方法同上）

2．結果

2.1 本次試驗的PCR基因芯片（21.3 mm ´ 17.5 mm）由192個微反應室組成，可以同時進行192個不同的PCR反應。芯片的長方體微反應室的長度為700um，寬度為600um，深為200um，體積約為35nl。每兩個微反應室之間的間距為1200um。微反應室之間由通道相連并匯集形成與外界相通的3個端口。其中較大的一個是供加入反應液用，其他較小的兩個是為了能夠排出氣泡與過量的反應液。加樣端口為主流道，又分為很多次流道，每個微反應室的入口與出口就與次通道相連，主流道寬140um；次流道寬50um。微反應室與流道腔的深度分別達到200um與50um。芯片進行熱氧化后表面的親水性增強，反應液可以在芯片內(nèi)順利流動。PVC聚合物壓合封閉芯片，因為PCR芯片需要事先在其表面點入若干DNA樣本或引物，封閉材料不僅有良好的導熱性、密閉性、對PCR反應無抑制且在封閉過程中不能對點入的DNA樣本有損。

2.2 PCR-SSCP并測序分析發(fā)現(xiàn)X連鎖遺傳性鐵幼粒細胞貧血家系ALAS2基因第5外顯子基因異常
分析兩兄弟及其父母、外祖父母的ALAS2基因，兩兄弟ALAS2基因第5外顯子的PCR擴增產(chǎn)物有與正常臍血不同的單鏈電泳條帶，他們的父親和外祖父有與正常臍血相同的單鏈電泳條帶，而他們的母親和外祖母同時由上述兩種不同的條帶。提示兩患者的ALAS2基因存在異常，這一異�；�因來自母系。（圖1）測序表明兩患者的ALAS2第5外顯子有G514A的點突變，母親為雜合子攜帶者。

將DNA序列測定結果在互聯(lián)網(wǎng)上(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進行同源性分析確定兩患者ALAS2第5外顯子G514A點突變。

2.3 常規(guī)實時定量PCR在Gene Amp PCR System 2400 PCR儀用Taqman熒光探針能夠檢測ALAS2基因第五外顯子點突變 在Taqman探針對此家系中六位成員DNA與二份正常男性臍血DNA分析與預期結果完全相符，即：所研究家系中二名患者、外祖母、母親為陽性；家系中父親、外祖父以及二份正常男性臍血、陰性對照均為陰性（圖2）.

2.4 Taqman熒光PCR反應能夠在PCR基因芯片上進行。

同樣的樣本在PCR基因芯片反應，結果與常規(guī)實時定量PCR反應的結果相符。
即：所研究家系中二名患者（1、2）、外祖母、母親（3、4）為陽性；家系中父親、外祖父（5、6）以及一份正常男性臍血（7）均為陰性；0號為陰性對照（圖3）。表明Taqman熒光PCR反應能夠在PCR基因芯片上順利進行


2.5 用SYBR Green熒光染料做常規(guī)實時定量PCR分析HLA
應用位點特異性PCR(SCP)方法從20例正常人中確定2位HLAA2（編號1、2）與2位HLA非A2（編號3、4）。 在GeneAmp ®SDS 5700檢測SYBR熒光染料4步位點特異PCR反應（圖4）SYBR熒光染料PCR反應結果與預期相符。


2.6 在PCR基因芯片上進行SYBR熒光染料PCR反應
PCR基因芯片結果與常規(guī)實時定量PCR反應一致。圖5示第一步SCP反應結果：1號標本為陽性，3號標本為陰性，0為陰性對照.


3．討論

隨著近年基因芯片技術的發(fā)展，研究者逐漸認識到基于核酸雜交原理的傳統(tǒng)基因芯片缺陷與應用的局限性。隨著PCR技術的進展，特別是熒光定量PCR技術的出現(xiàn)PCR技術已成為生物醫(yī)學領域中應用最廣泛的技術。如果一種基因芯片能直接進行PCR反應,而且能夠同時擴增大批可能發(fā)生變異的基因顯然會有廣泛的用途。我們與微電子所合作，利用其微加工能力，首次建立含有數(shù)百上千微反應池的PCR基因芯片。近年來熒光PCR方法有所發(fā)展，我們設想在如果芯片上設置多個微反應池進行熒光PCR反應，通過檢測芯片上熒光的變化來確定反應結果，可以免去電泳等繁瑣的檢測過程，并且可在不同反應池中同時進行多個反應。PCR反應在芯片內(nèi)極小容積的微反應池中進行，每個微反應池均可以將其內(nèi)部的基因擴增數(shù)百萬倍，解決了常規(guī)PCR一次僅僅可以分析一種或者少數(shù)幾種基因的不足。微反應池內(nèi)的反應介質(zhì)的量僅為普通PCR一次反應的量，也會大大節(jié)約試劑開支。

PCR基因芯片的研制面臨重要問題是在僅數(shù)十納升的微反應池中能否進行微量的熒光PCR反應？熒光的變化能否準確檢測？如何選擇用于不同用途的PCR反應類型？

我們利用臨床病例和正常人實際例證，探討利用Taqman探針和SYBR Green熒光染料在PCR基因芯片上做熒光PCR反應的可行性。
TaqMan熒光探針是特異合成的寡核苷酸序列［9］，其5’、3’分別標有熒光報告基團（如FAM）、熒光淬滅基團（TAMRA）。在PCR擴增前，TAMRA通過Föster能量遷移（FRET）作用，抑制FAM的熒光發(fā)射。如PCR產(chǎn)物中有靶序列存在，則在PCR擴增的延伸階段，Taq酶通過其5’→3’外切酶活性將結合的TaqMan探針切斷，F(xiàn)AET抑制作用被解除，后者的熒光信號得以釋放出來，模板DNA每復制一次，就有一個熒光信號被釋放［10-11］。我們所設計的檢測遺傳性鐵幼粒細胞貧血家系G514A點突變的探針，結果證明這類反應能在PCR基因芯片上順利反應。在結果圖中可以看出陰性與陽性結果之間差別仍很明顯。但是，TaqMan熒光探針的應用仍然存在問題，大量合成TaqMan熒光探針會十分昂貴，平衡大量PCR反應的條件也是很困難的事。我們又試用熒光染料SYBR
Green。SYBR Green可以與雙鏈DNA結合。在PCR過程中，隨著擴增過程的進行，雙鏈PCR產(chǎn)物不斷增多，越來越多的熒光染料與雙鏈DNA結合。收集結合到雙鏈DNA上的SYBR Green熒光信號就可以直接檢測各種PCR產(chǎn)物的量。我們用SYBR Green熒光染料和位點特異PCR反應檢測HLAA2與非A2，說明這一類型的熒光PCR反應能在芯片上應用。

TaqMan探針熒光PCR反應與SYBR Green熒光染料PCR反應各有其優(yōu)缺點。SYBR Green熒光染料主要優(yōu)點是不用針對每個PCR反應設計探針等，缺點是其特異性較差，原因是SYBR Green是非選擇性的與雙鏈DNA結合。幸運的是通過測定解離曲線可以排除假陽性結果。用PCR芯片檢測腫瘤融合基因類型的工作中，如果無法設計數(shù)百個Taqman探針對不同的融合基因進行檢測，那么SYBR Green熒光染料PCR反應則是很好的選擇�？梢允孪仍谛酒�上點上檢測不同融合基因所需要的引物，然后將包括SYBR Green熒光染料的反應液加入，檢測一個樣本多個不同融合基因的變化。

我們將芯片技術與熒光PCR技術相結合，利用TaqMan探針與SYBR Green熒光染料檢測在微反應池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。用一些臨床標本實例，觀察在基因芯片上進行不同的熒光摻入PCR反應，發(fā)現(xiàn)這些熒光PCR反應可以在芯片上順利進行，可以根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。為PCR基因芯片的臨床應用打下了基礎。

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(HAO Lin） ZHU Ping1）＊ YU Xiao-Mei2） ZHANG Da-Cheng） ZHAO Xin-Sheng OUYANG
Jian-Hua）

（1）Peking University First Hospital Beijing 100034；
（2）Department of
Microelectronics , Peking University Beijing 100871；
（3）College of Chemistry and Molecular Engineering , Peking University Beijing 100871） Abstract Objectives: To prove if fluorescence PCR which is used for different purposes can be carried through successfully on PCR chips and whether the changes of fluorescence can be detected. To compare the advantages and disadvantages of different methods of fluorescence PCR. Methods: We designed and fabricated a PCR gene chip, which is made of silicon wafer. A point mutation was identified by using SSCP and sequencing a hereditary X chromosome linked sideroblastic anemia family. A Taqman probe specifically to detect this point mutation was designed and used in fluorescence PCR. We carried out the fluorescence PCR on a gene chip and in tubes, and compared the results from the two methods. We also used the 4 steps of site-specific PCR and SYBR fluorescent staining to detect HLA-A2 on the chip and compared the results with that from routine method. Results: A silicon PCR gene chip was designed and fabricated which contains 192 reaction chambers. The point mutation of G514A in the exon 5 of ALAS2 in a hereditary X-linked sideroblastic anemia family was confirmed by PCR-SSCP and seqencing. The results of the 6 members in the anemic family and 2 normal male newborns using Taqman probe we designed and the fluorescence PCR on chip were the same as those form routine method. The results of the routine SYBR fluorescent staining PCR and the reactions on chip were consistent with the expectations. Conclusions: Taqman fluorescence PCR can be carried out successfully on the chip and is suitable for the detection of point mutation and single nucleic polymorphorim. Fluorescence PCR with SYBR fluorescence staining can be performed on the chip and may be useful for the screening of fusion genes in cancer samples.

Keywords: PCR chip; Fluorescence PCR;Taqman probe;SYBR fluorescence staining；