使用非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）研究鹽脅迫的新機(jī)制

前言

在鹽生環(huán)境中，Na⁺的毒性是降低植物生長(zhǎng)能力的一個(gè)主要原因。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常使用幾種方法來(lái)減少Na⁺的毒性，使用復(fù)合物，例如石灰、石膏。在不同的植物中廣泛報(bào)道了增加Ca²⁺可以改善Na⁺的毒性。然而，在細(xì)胞水平Ca²⁺的調(diào)節(jié)機(jī)制并未完全得知。Ca²⁺和大量的胞內(nèi)和胞外標(biāo)記物發(fā)生相互作用而減少Na⁺的毒性。目前，SOS脅迫信號(hào)途徑是鹽脅迫下植物離子動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。鹽脅迫激活了SOS3-SOS2蛋白激酶途徑從而引起了胞質(zhì)Ca²⁺濃度的升高。這導(dǎo)致質(zhì)膜Na⁺外流轉(zhuǎn)運(yùn)體SOS1和通過(guò)質(zhì)膜高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體HKT1的Na⁺內(nèi)流，因此幫助細(xì)胞保持K⁺/Na⁺的動(dòng)態(tài)平衡。胞液中Ca²⁺濃度上升的范圍依賴于胞外的Ca²⁺濃度，直接支持這個(gè)模型的實(shí)驗(yàn)證據(jù)一直很缺乏。

增加胞外Ca²⁺濃度能夠通過(guò)CaM依賴的蛋白激酶刺激質(zhì)膜H⁺-ATPase的活性。在鹽脅迫條件下，增加質(zhì)膜H⁺-ATPase活性對(duì)于膜電壓的重新極化是必需的，從而保持膜的完整性和離子的動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)SOS1 Na⁺-H⁺反向轉(zhuǎn)運(yùn)體控制的Na⁺外流最終依賴于H⁺-ATPase的活性。擬南芥根內(nèi)胚層質(zhì)膜H⁺-ATPase活性的喪失導(dǎo)致對(duì)鹽的敏感性。SOS3-SOS2途徑的Ca²⁺刺激過(guò)Na⁺-H⁺反向轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)液泡Na⁺的丟失。因此，Ca²⁺作為一個(gè)胞內(nèi)調(diào)控者在鹽忍耐中起到重要作用。

Ca²⁺提供快速的保護(hù)作用，而細(xì)胞壁、膜脂和蛋白質(zhì)提供長(zhǎng)期的保護(hù)作用來(lái)抵御鹽脅迫。胞外Ca²⁺通過(guò)Na⁺內(nèi)流抑制質(zhì)膜滲透性非選擇陽(yáng)離子通道（NSCCs）。使用多種電生理技術(shù)進(jìn)行研究，例如：非損傷離子流測(cè)定技術(shù)、多種平行離子選擇電極技術(shù)、膜片鉗技術(shù)、膜電位測(cè)定。在根和葉片細(xì)胞中，胞外的Ca²⁺能夠通過(guò)質(zhì)膜外表K⁺滲透通道直接抑制減少或者完全阻止Na⁺誘導(dǎo)的K⁺流失， 這是Ca²⁺通過(guò)K⁺通道改善Na⁺誘導(dǎo)的毒性的另一種關(guān)鍵過(guò)程。

本文重點(diǎn)介紹：如何準(zhǔn)備適用于非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定的植物組織樣品，如何進(jìn)行測(cè)定，以及得到的結(jié)果。

材料和方法

1 植物材料

擬南芥：野生型（Columbia），akt1突變體

2 利用非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定凈K⁺和Na⁺的流動(dòng)

使用離子選擇振動(dòng)微電極進(jìn)行非損傷測(cè)量K⁺和Na⁺的凈流量。電極在使用前用一套標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，0.1-1mM的K⁺，0.2-50mM的Na⁺。離子選擇電極放置于可控制三維運(yùn)動(dòng)的操縱器上，電極尖端距離組織表面20μm。測(cè)量時(shí)，計(jì)算機(jī)控制電極在距離組織表面20μm和50μm的兩點(diǎn)間移動(dòng)，頻率為0.2Hz。記錄的電勢(shì)差使用校正電極的Nernst斜率轉(zhuǎn)換成電化學(xué)電勢(shì)差，離子的流動(dòng)通過(guò)進(jìn)行計(jì)算。

葉片表皮組織用鑷子從葉表皮分離得到，切取小塊組織（3-×4mm），盡可能地避免對(duì)組織的傷害，準(zhǔn)備好幾小時(shí)后開(kāi)始離子流的測(cè)定，使用NMT(或稱MINF)測(cè)定擬南芥的根尖（切取大約8mm的根尖部分）。根或者葉片水平固定在4mL 的測(cè)量容器中，測(cè)試液是堿性溶液，包括0.2mM KCl，2mM MES，4mM Tris （pH 5.8），以及少量的CaCl₂，放在三維操作系統(tǒng)上。穩(wěn)定狀態(tài)的離子流測(cè)定5-10分鐘。然后測(cè)定的結(jié)果轉(zhuǎn)換成離子流動(dòng)力學(xué)。

研究結(jié)果

1 擬南芥根和葉片中NaCl誘導(dǎo)Ca²⁺敏感的K⁺外流

根成熟表皮（A）和葉肉組織（B）在不同的Ca²⁺濃度中K⁺流速的不同響應(yīng)

2 NaCl誘導(dǎo)K⁺外流與Cl^-或滲透刺激無(wú)關(guān)，對(duì)TEA⁺敏感

NaCl誘導(dǎo)的K⁺外流反應(yīng)和Cl^-無(wú)關(guān)，由于50mM 葡萄糖酸鈉在擬南芥根中引起和50mM NaCl基本同樣的反應(yīng)。當(dāng)添加等壓的85mM 的甘露醇來(lái)代替50mM 的NaCl時(shí)，沒(méi)有K⁺外流。同樣的結(jié)果也在葉肉組織中觀察到。NaCl誘導(dǎo)的K⁺外流很大程度上被K⁺通道抑制劑TEA⁺抑制，但是不被Ca²⁺通道抑制劑戊脈安（verapamil）抑制。對(duì)TEA⁺的敏感是K⁺通道內(nèi)在的特性，與其他的陽(yáng)離子滲透通道不同，例如NSCCs和Ca²⁺通道，這些對(duì)TEA⁺不敏感。

3 NaCl誘導(dǎo)的K⁺外流先于Na⁺的內(nèi)流

向內(nèi)調(diào)節(jié)不涉及到NaCl誘導(dǎo)的K⁺流失

提高Na⁺濃度誘導(dǎo)Ca²⁺敏感的凈K⁺的外流可能通過(guò)質(zhì)膜TEA⁺敏感的外表直接的K⁺通道的活化作用所調(diào)節(jié)。

研究結(jié)論

NaCl引起的K⁺流失是由于Na⁺誘導(dǎo)的TEA⁺敏感K⁺的外流，非常可能是由兩個(gè)滲透通道的成員DAPCs和NSCCs調(diào)節(jié)。提高調(diào)節(jié)了擬南芥根和葉片中的這些通道并且阻止了K⁺的流失。在鹽脅迫下，Na⁺顯著抑制DAOCs，但是不抑制NSCCs。因此，K⁺外流的敏感成分很大程度上視NSCCs的情況而定。這些結(jié)果挑戰(zhàn)Ca²⁺在植物中發(fā)揮作用機(jī)制的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。Ca²⁺對(duì)Na⁺內(nèi)流的抑制效應(yīng)是通過(guò)NSCCs實(shí)現(xiàn)的，非質(zhì)體Ca²⁺通過(guò)直接和間接調(diào)節(jié)K⁺外流通道來(lái)阻止K⁺的流失。

采用非損傷微測(cè)技術(shù)來(lái)測(cè)定K⁺和Na⁺的凈流量以及胞液中K⁺流速，探明了K⁺通道中的K⁺變化情況。對(duì)于認(rèn)識(shí)鹽脅迫下不同離子所引起的抗性作用有重要的意義。非損傷微測(cè)技術(shù)能夠精確地測(cè)定離子流的瞬時(shí)變化以及長(zhǎng)期變化的過(guò)程。由于它所具有的這種優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在小分子物質(zhì)的測(cè)定方面得到廣泛的應(yīng)用。在此文中，這個(gè)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于揭開(kāi)Ca²⁺所引起的K⁺滲透通道來(lái)改善K⁺流失并去除Na⁺的毒害有明顯優(yōu)勢(shì)。

參考文章：

S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ, Davies JM, and Newman IA. (2006) Extracellular Ca²⁺ ameliorates NaCl-induced K⁺ loss from Arabidopsis root and leaf cells by controlling plasma membrane K⁺-permeable channels. Plant Physiology, 141: 1653-1665

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