植物無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)

植物無(wú)糖組培快繁技術(shù)（Sugar-free micropropagation）又稱為光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)（Photoautotrophic micropropagation）是指在植物組織培養(yǎng)中改變碳源的種類，以CO₂代替糖作為植物體的碳源，通過(guò)輸入CO₂氣體作為碳源，并控制影響試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境因子，促進(jìn)植株光合作用，使試管苗由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型，進(jìn)而生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗的一種新的植物微繁殖技術(shù)。這一技術(shù)概念是在1980年提出的，其技術(shù)發(fā)明人是日本千葉大學(xué)的古在豐樹(shù)教授。20世紀(jì)90年代以后，這一技術(shù)成為植物微繁殖研究的新領(lǐng)域，受到廣泛的關(guān)注，無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)也在各國(guó)開(kāi)始得到推廣應(yīng)用。特別是近幾年來(lái)，從事這一技術(shù)領(lǐng)域研究的科技人員越來(lái)越多，這一技術(shù)也逐漸成熟，并開(kāi)始應(yīng)用于植物微繁殖工廠化生產(chǎn)。本文從植物無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)、限制因素、研究進(jìn)展和應(yīng)用前景等方面對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 植物無(wú)糖組培快繁的技術(shù)特點(diǎn)
1.1 CO₂代替了糖作為植物體的碳源
在一般的有糖培養(yǎng)微繁殖中，小植物是以糖（如蔗糖、白砂糖、果糖等）作為主要碳源進(jìn)行異養(yǎng)或兼養(yǎng)生長(zhǎng)，糖被看作是植物組織培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中。而無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖是以CO₂作為小植株的唯一碳源，通過(guò)自然或強(qiáng)制性換氣系統(tǒng)供給小植株生長(zhǎng)所需CO2，促進(jìn)植物的光合作用進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)。
1.2 環(huán)境控制促進(jìn)植株的光合速率
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中，很少對(duì)植株生長(zhǎng)的微環(huán)境進(jìn)行研究，研究的重點(diǎn)是放在培養(yǎng)基的配方以及激素的用量和有機(jī)物質(zhì)的添加上；而無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)是建立在對(duì)培養(yǎng)容器內(nèi)環(huán)境控制的基礎(chǔ)上，根據(jù)容器中植株生長(zhǎng)所需的最佳環(huán)境條件（如光照強(qiáng)度、CO₂濃度、環(huán)境濕度、溫度、培養(yǎng)基質(zhì)等）來(lái)對(duì)植株生長(zhǎng)的微環(huán)境進(jìn)行控制，最大限度地提高小植株的光合速率，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。
1.3 使用多功能大型培養(yǎng)容器
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)基中糖的存在，為了防止污染，一般使用或者說(shuō)只能使用小的培養(yǎng)容器。而無(wú)糖培養(yǎng)在培養(yǎng)過(guò)程中不使用糖及各類有機(jī)物質(zhì)，極大地避免了污染的發(fā)生，可以使用各種類型的培養(yǎng)容器，小至試管，大至培養(yǎng)室。
1.4 多孔的無(wú)機(jī)材料作為培養(yǎng)基質(zhì)
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中，通常使用瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)，而無(wú)糖培養(yǎng)主要是采用多孔的無(wú)機(jī)物質(zhì)，如蛭石、珍珠巖、纖維、Florialite（一種蛭石和纖維的混合物）作為培養(yǎng)基質(zhì)，可以極大地提高小植株的生根率和生根質(zhì)量（肖玉蘭，2003）。
1.5 閉鎖型培養(yǎng)室
傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中的培養(yǎng)室是半開(kāi)放的，有許多的窗戶以利于陽(yáng)光直接進(jìn)入培養(yǎng)室，但自然光在進(jìn)入培養(yǎng)室的同時(shí)也增加了降溫的成本，而且，一年四季、春夏秋冬，晴天、陰天、雨天，早晨、中午、下午、光的強(qiáng)度和分布是不均勻的。而無(wú)糖培養(yǎng)采用的是閉鎖型的培養(yǎng)室，通過(guò)人工或自動(dòng)調(diào)控整個(gè)培養(yǎng)室環(huán)境，能周年進(jìn)行穩(wěn)定的生產(chǎn)。

2 植物無(wú)糖組培快繁技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
植物無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)改革了傳統(tǒng)的用糖和瓶子作為碳源營(yíng)養(yǎng)和生存空間的技術(shù)方法，增加了植物生長(zhǎng)和生化反應(yīng)所需的物質(zhì)流的交換和循環(huán)，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)苗低成本的生產(chǎn)。優(yōu)越如下：
1） 通過(guò)人工控制動(dòng)態(tài)調(diào)整優(yōu)化植物生長(zhǎng)環(huán)境，為種苗繁殖生長(zhǎng)提供最佳的CO₂濃度、光照、濕度、溫度等環(huán)境條件，提高植株的光合速率，促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)發(fā)育，苗齊、苗壯。
2） 繼代與生根培養(yǎng)過(guò)程合二為一，培養(yǎng)周期縮短了40％以上。
3） 大幅度減少了植物微繁殖生產(chǎn)過(guò)程中的微生物污染率。
4） 消除了小植株生理和形態(tài)方面的紊亂，種苗質(zhì)量顯著提高。
5） 提高了植株的生根率和生根質(zhì)量，特別是對(duì)于木本植物來(lái)說(shuō)，極大地植株的生根率和生根質(zhì)量，試管苗移栽成活率顯著提高。
6） 節(jié)省投資，降低生產(chǎn)成本。與傳統(tǒng)的微繁殖技術(shù)相比，種苗生產(chǎn)綜合成本平均降低30％（Xiao et al.，2004; Zobayed et al.，2004）。
7） 組培生產(chǎn)工藝的簡(jiǎn)單化，流程縮短，技術(shù)和設(shè)備的集成度提高，降低了操作技術(shù)難度和勞動(dòng)作業(yè)強(qiáng)度，更易于在規(guī)�；�生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
8） 培養(yǎng)不受培養(yǎng)容器的限制，可實(shí)現(xiàn)穴盤(pán)苗商業(yè)化生產(chǎn)，也可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模容器自動(dòng)工廠化生產(chǎn)。

3 植物無(wú)糖組培快繁技術(shù)的限制因素
1) 需要相對(duì)復(fù)雜的微環(huán)境（容器內(nèi)環(huán)境）控制的知識(shí)和技巧
植物無(wú)糖組織培養(yǎng)微繁殖的研究和試驗(yàn)已經(jīng)非常成功，但實(shí)際應(yīng)用還是受到一定的限制，其中的一個(gè)主要原因就是需要應(yīng)用微環(huán)境控制方面專業(yè)的技術(shù)。沒(méi)有充分理解容器中小植株的生理特性，容器內(nèi)的環(huán)境，容器外的環(huán)境，培養(yǎng)容器的物理或構(gòu)造特性之間的關(guān)系，將不可能成功地應(yīng)用光自養(yǎng)微繁殖系統(tǒng)，使用最少的能源和原料生產(chǎn)高品質(zhì)的植株。光自養(yǎng)微繁殖控制系統(tǒng)的復(fù)雜性會(huì)導(dǎo)致設(shè)施設(shè)計(jì)的失敗，必須在充分認(rèn)識(shí)和理解了光自養(yǎng)微繁殖的原理后，才能取得成功。
2） 培養(yǎng)的植物材料受到限制
與一般的微繁殖相比，光自養(yǎng)微繁殖需要較高質(zhì)量的芽和莖，外植體需具有一定的葉面積，帶綠色子葉的體細(xì)胞胚也可進(jìn)行光自養(yǎng)生長(zhǎng)（Kozai T. et al.，2005）。外植體的質(zhì)量越好培養(yǎng)效果越佳。

4 植物無(wú)糖組培快繁技術(shù)研究進(jìn)展
植物無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展，基礎(chǔ)理論的建立和研究已經(jīng)成熟，但商業(yè)化的應(yīng)用還處于起步階段。在植物無(wú)糖組織快繁技術(shù)的應(yīng)用中，CO₂的供給和濃度的調(diào)控是其關(guān)鍵技術(shù)之一。在植物無(wú)糖組織培養(yǎng)過(guò)程中，為了增加培養(yǎng)容器中的CO2濃度，可采用兩種不同的CO2補(bǔ)充方式，一種是在密封的容器上使用透氣膜，通過(guò)自然換氣方式提供小植株光合作用所需的CO₂（Aitken-Christie et al.，1995）。隨著無(wú)糖組織培養(yǎng)培養(yǎng)容器的不斷增大，強(qiáng)制性換氣系統(tǒng)得到了應(yīng)用（Kozai T. et al.，2000；Xiao et al.2005）。與自然換氣相比，強(qiáng)制性換氣具有CO₂濃度容易控制，操用方便，植物生長(zhǎng)發(fā)育加快等特點(diǎn)。Xiao等（2005）在對(duì)calla lily和China fir進(jìn)行的無(wú)糖培養(yǎng)研究表明，采用120L的培養(yǎng)容器，通過(guò)強(qiáng)制性換氣系統(tǒng)直接輸入CO₂供植物生長(zhǎng)。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方式（培養(yǎng)基中添加蔗糖）相比，calla
lily的培養(yǎng)周期縮短50%、苗木移栽成活率由50%提高到95%；China fir苗木質(zhì)量顯著提高，繼代和生根過(guò)程合二為一，且沒(méi)有愈傷組織的發(fā)生，而有糖培養(yǎng)則在基部產(chǎn)生愈傷組織，嚴(yán)重影響苗木移栽成活率。Xiao等(2005)等對(duì)Gerberas進(jìn)行的無(wú)糖培養(yǎng)研究表明，與有糖培養(yǎng)相比，采用大規(guī)模容器和強(qiáng)制性換氣系統(tǒng)進(jìn)行的無(wú)糖組織培養(yǎng)，植株的葉面積、莖干重分別提高5.2和4.6倍，植株的凈光合速率和葉綠素含量分別提高9.2和2.2倍，苗木生根率和移栽成活率分別由62%、57%提高到98%、95%。(Tanaka M. et al.， 2005)、(Teixeira J.A. et al., 2006)進(jìn)行桉樹(shù)的無(wú)糖組織培養(yǎng)研究表明，一種新型的小培養(yǎng)容器Vitron能提高試管苗在無(wú)糖培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)質(zhì)量，適合進(jìn)行無(wú)糖組織培養(yǎng)生產(chǎn)。
在植物無(wú)糖組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)試管苗生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)也是一個(gè)非常重要的因素。Afreen-Zobayed等（1999）對(duì)甘薯進(jìn)行了瓊脂、gellan gum、蛭石、cellulose和Florialite等五種不同培養(yǎng)基質(zhì)的無(wú)糖培養(yǎng)比較試驗(yàn)，研究結(jié)果表明，以Florialite為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)的試管苗質(zhì)量?jī)?yōu)于以瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生的試管苗，其中葉、根鮮重分別是后者的2.4和2.9倍，干重分別是后者的2.2和2.8倍，且以Florialite為基質(zhì)產(chǎn)生的試管苗凈光合速率最高。（Xiao et al., 2006）對(duì)statice進(jìn)行的無(wú)糖組織培養(yǎng)研究也表明，與瓊脂相比，F(xiàn)lorialite顯著提高試管苗生長(zhǎng)和根的發(fā)生，以及凈光合速率。另外，光量子通量（Xiao et al., 2003）、培養(yǎng)容器換氣次數(shù)（Xiao et al., 2006）等環(huán)境因子均對(duì)試管苗生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。
到目前為止，植物無(wú)糖組織快繁技術(shù)已經(jīng)在60余種植物中獲得成功。與有糖培養(yǎng)相比，無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)顯示出其特有的優(yōu)勢(shì)。特別是對(duì)于木本植物來(lái)說(shuō)，無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)能顯著改善根的質(zhì)量，提高生根率，消除了小植株生理和形態(tài)方面的紊亂，種苗質(zhì)量顯著提高（Kozai T. et al.，2005）。（Afreen. et al., 2002a, b）以咖啡植物作為研究對(duì)象，利用無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量體細(xì)胞胚胎發(fā)生方面的研究，研究結(jié)果表明，無(wú)糖組織培養(yǎng)能提高體細(xì)胞的質(zhì)量，減少玻璃化和不正常體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)率，而且體細(xì)胞發(fā)生發(fā)育時(shí)期、大小比較均勻，便于工廠化生產(chǎn)。研究指出，無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)可能成為體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理研究的有效工具或途徑。隨著無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善和成熟，這一技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始在商業(yè)上慢慢得到應(yīng)用和推廣（Kozai T. et al.，2004；Kozai T. et al.，2006）。

5、植物無(wú)糖組培快繁技術(shù)應(yīng)用前景
無(wú)糖組織培養(yǎng)微繁殖技術(shù)作為一項(xiàng)高新技術(shù)，在基礎(chǔ)科學(xué)研究和實(shí)踐生產(chǎn)中均具有廣闊的應(yīng)用前景（Kozai T. et al.，2005）。
1．在無(wú)糖組織培養(yǎng)過(guò)程中，主要是通過(guò)環(huán)境調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)。因此，可以從環(huán)境調(diào)節(jié)角度來(lái)研究試管苗形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理等方面的基礎(chǔ)科學(xué)研究。
2．無(wú)糖組織快繁技術(shù)可有效解決藤木、木本植物生根難的問(wèn)題，可進(jìn)行這方面的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。
3. 可進(jìn)行試管苗繼代、生根、馴化同步研究，縮短培養(yǎng)周期。
4．可進(jìn)行瀕危珍稀植物及高附加值植物的人工培育等方面研究。
5．可進(jìn)行種質(zhì)資源保存方面的研究。
6．隨著材料科學(xué)、物理農(nóng)業(yè)的發(fā)展，以及植物無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)理論體系的成熟，這一技術(shù)將以低成本生產(chǎn)高質(zhì)量種苗的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用于植物種苗工廠化生產(chǎn)。