毛細(xì)管電泳工作原理(capillary electrophoresis, CE)

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛細(xì)管電泳(HPCE), 是近年來發(fā)展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離, 創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。1987年Hjerten 建立了毛細(xì)管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988～1989年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器。短短幾年內(nèi), 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽、蛋白質(zhì)(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發(fā)展。

　　CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE和高效液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是高效分離技術(shù), 儀器操作均可自動(dòng)化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間, CE的分析時(shí)間通常不超過30min, 比HPLC速度快；對(duì)CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比, 對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級(jí), 最低可達(dá)270fl, 流動(dòng)相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級(jí), 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備, 而HPLC可作常量制備。

　　CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場, 因此分離速度要快得多；檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè)；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多�？傊�, CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少：高靈敏度, 常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率, 其每米理論塔板數(shù)為幾十萬；高者可達(dá)幾百萬乃至千萬, 而HPLC一般為幾千到幾萬；高速度, 最快可在60s內(nèi)完成, 在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì), 1.7min分離19種陽離子, 3min內(nèi)分離30種陰離子； 樣品少, 只需nl (10-9 L)級(jí)的進(jìn)樣量；成本低, 只需少量(幾毫升)流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力, 使CE成為近年來發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。當(dāng)然CE還是一種正在發(fā)展中的技術(shù), 有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開發(fā)。

　　“CE”統(tǒng)指以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力, 以毛細(xì)管為分離通道, 依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。（見圖16 毛細(xì)管電泳儀器示意圖）。其儀器結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源, 一根毛細(xì)管, 一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中, 帶電粒子在電場作用下, 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。

　　CE所用的石英毛細(xì)管柱, 在pH>3情況下, 其內(nèi)表面帶負(fù)電, 和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲, 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致, 故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。

　　電滲是CE中推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力, 它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻速度向前運(yùn)動(dòng), 使整個(gè)流型呈近似扁平型的“塞式流”。（見圖）它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。但在HPLC中,采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型, 其中心處速度是平均速度的兩倍, 導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張, 引起柱效下降, 使其分離效率不如CE。

　　理論分析表明, 增加速度是減少譜帶展寬、提高效率的重要途徑, 增加電場強(qiáng)度可以提高速度。但高場強(qiáng)導(dǎo)致電流增加, 引起毛細(xì)管中電解質(zhì)產(chǎn)生焦耳熱(自熱)。自熱將使流體在徑向產(chǎn)生拋物線型溫度分布, 即管軸中心溫度要比近壁處溫度高。因溶液粘度隨溫度升高呈指數(shù)下降, 溫度梯度使介質(zhì)粘度在徑向產(chǎn)生梯度, 從而影響溶質(zhì)遷移速度, 使管軸中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快, 造成譜帶展寬, 柱效下降。

　　一般來說溫度每提高1℃, 將使淌度增加2% (所謂淌度, 即指溶質(zhì)在單位時(shí)間間隔內(nèi)和單位電場上移動(dòng)的距離)。此外, 溫度改變使溶液pH值、粘度等發(fā)生變化, 進(jìn)一步導(dǎo)致電滲流、溶質(zhì)分子的電荷分布(包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu))、離子強(qiáng)度等的改變, 造成淌度改變、重復(fù)性變差、柱效下降等現(xiàn)象。降低緩沖液濃度可降低電流強(qiáng)度, 使溫差變化減小。高離子強(qiáng)度緩沖液可阻止蛋白質(zhì)吸附于管壁, 并可產(chǎn)生柱上濃度聚焦效應(yīng), 防止峰擴(kuò)張, 改善峰形。減小管徑在一定程度上緩解了由高電場引起的熱量積聚, 但細(xì)管徑使進(jìn)樣量減少, 造成進(jìn)樣、檢測(cè)等技術(shù)上的困難。因此, 加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。液體的導(dǎo)熱系數(shù)要比空氣高100倍�，F(xiàn)在有的采用液體冷卻方式的毛細(xì)管電泳儀可使用離子強(qiáng)度高達(dá)0.5mol/L的緩沖液進(jìn)行分離, 或使用200 μm直徑的毛細(xì)管進(jìn)行微量制備, 仍能達(dá)到良好的分離效果和重現(xiàn)性。

　�。茫努F(xiàn)有六種分離模式，分述如下：

　　1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又稱毛細(xì)管自由電泳, 是CE中最基本、應(yīng)用最普遍的一種模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。

　　2. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC), 是把一些離子型表面活性劑 (如十二烷基硫酸鈉, SDS) 加到緩沖液中, 當(dāng)其濃度超過臨界濃度后就形成有一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。雖然膠束帶負(fù)電, 但一般情況下電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度, 故膠束將以較低速度向陰極移動(dòng)。溶質(zhì)在水相和膠束相(準(zhǔn)固定相)之間產(chǎn)生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差異, 疏水性強(qiáng)的膠束結(jié)合牢, 流出時(shí)間長, 最終按中性粒子疏水性不同得以分離。MECC使CE能用于中性物質(zhì)的分離, 拓寬了CE的應(yīng)用范圍, 是對(duì)CE極大的貢獻(xiàn)。

　　3. 毛細(xì)管凝膠電泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用, 溶質(zhì)按分子大小逐一分離。凝膠粘度大, 能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散, 所得峰形尖銳, 能達(dá)到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱, 可分離、測(cè)定蛋白質(zhì)和DNA的分子量或堿基數(shù), 但其制備麻煩, 使用壽命短。如采用粘度低的線性聚合物如甲基纖維素代替聚丙烯酰胺, 可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分(Non-Gel Sieving)介質(zhì)。它能避免空泡形成, 比凝膠柱制備簡單,壽命長, 但分離能力比凝膠柱略差。CGE和無膠篩分正在發(fā)展成第二代DNA序列測(cè)定儀, 將在人類基因組織計(jì)劃中起重要作用。

　　4. 毛細(xì)管等電聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 將普通等電聚焦電泳轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。通過管壁涂層使電滲流減到最小, 以防蛋白質(zhì)吸附及破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶, 再將樣品與兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣, 兩端貯瓶分別為酸和堿。加高壓(6～8kV)3～5min后, 毛細(xì)管內(nèi)部建立pH梯度,蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中向各自等電點(diǎn)聚焦, 形成明顯的區(qū)帶。最后改變檢測(cè)器末端貯瓶內(nèi)的pH值, 使聚焦的蛋白質(zhì)依次通過檢測(cè)器而得以確認(rèn)。

　　5. 毛細(xì)管等速電泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是一種較早的模式, 采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì), 使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離, 常用于分離離子型物質(zhì), 目前應(yīng)用不多。

　　6. 毛細(xì)管電色譜 (capillary electrochromatography, CEC) 是將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中, 以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)制, 以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過程, 雖柱效有所下降, 但增加了選擇性。此法有發(fā)展前景。

　　毛細(xì)管電泳 (CE) 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點(diǎn)外, 其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜 (HPLC) 簡單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn), 困難之處在于檢測(cè)器。特別是光學(xué)類檢測(cè)器, 由于毛細(xì)管電泳溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積的特性導(dǎo)致光程太短, 而且圓柱形毛細(xì)管作為光學(xué)表面也不夠理想, 因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高。

　　當(dāng)然在CE中也有利于檢測(cè)的因素, 如：在HPLC中, 因稀釋之故,溶質(zhì)到達(dá)檢測(cè)器的濃度一般是其進(jìn)樣端原始濃度的1%, 但在CE中, 經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后, 可使溶質(zhì)區(qū)帶到達(dá)檢測(cè)器時(shí)的濃度和在進(jìn)樣端開始分離前的濃度相同。而且CE中還可采用堆積等技術(shù)使樣品達(dá)到柱上濃縮效果, 使初始進(jìn)樣體積濃縮為原體積的1/10～1%, 這對(duì)檢測(cè)十分有利。因此從檢測(cè)靈敏度的角度來說, HPLC具有良好的濃度靈敏度, 而CE提供了很好的質(zhì)量靈敏度�？傊�, 檢測(cè)仍是CE中的關(guān)鍵問題,有關(guān)研究報(bào)道很多, 發(fā)展也很快。迄今為止, 除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP)及紅外光譜未用于CE外, 其它檢測(cè)手段如：紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光等類型檢測(cè)器均已用于CE。

　　與HPLC類似, CE中應(yīng)用最廣泛的是紫外/可見檢測(cè)器。按檢測(cè)方式可分為固定波長或可變波長檢測(cè)器和二極管陣列或波長掃描檢測(cè)器兩類。前一類檢測(cè)器采用濾光片或光柵來選取所需檢測(cè)波長, 優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)構(gòu)簡單, 靈敏度比后一類檢測(cè)器高；后一類檢測(cè)器能提供時(shí)間--波長--吸光度的三維圖譜, 優(yōu)點(diǎn)在于在線紫外光譜可用來定性、鑒別未知物。有些商用儀器的二極管陣列檢測(cè)器還可做到在線峰純度檢查, 即在分離過程中便可得知每個(gè)峰含有幾種物質(zhì)；缺點(diǎn)在于靈敏度比前一類略差。采用快速掃描的光柵獲取三維圖譜方式時(shí), 其掃描速度受到機(jī)械動(dòng)作速度的限制。用二極管陣列方式, 掃描速度受到計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)存貯容量大小的限制。由于CE的峰寬較窄, 理論上要求能對(duì)最窄的峰采集20個(gè)左右的數(shù)據(jù), 因此要很好地選取掃描頻率, 才能得到理想的結(jié)果。

　　毛細(xì)管電泳基本原理

　　毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE ）是八十年代后期在全球范圍內(nèi)迅速崛起的一種分離分析技術(shù)。具有快速、高效、高靈敏度、易定量、重現(xiàn)性好及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于小分子、小離子、多肽及蛋白質(zhì)的分離分析研究。它又在核酸分離方面顯示出巨大的潛力。電流通過導(dǎo)體時(shí)產(chǎn)生焦耳熱。傳統(tǒng)平板凝膠電泳的最大局限性在于其無法克服兩端高電壓帶來的焦耳熱所產(chǎn)生的負(fù)面影響。焦耳熱可使篩分介質(zhì)內(nèi)部出現(xiàn)溫度、粘度及分離速度的不均一，影響遷移、降低效率、使區(qū)帶變寬。由于這種負(fù)面影響與電場強(qiáng)度成正比，所以極大地限制了高電壓的引入。也難以提高電泳速度。毛細(xì)管電泳使樣品在一根極細(xì)的柱子中進(jìn)行分離。細(xì)柱可減小電流，使焦耳熱的產(chǎn)生減少；同時(shí)又增大了散熱面積，提高散熱效率，大大降低了管中心與管壁間的溫差，減少了柱子徑向上的各種梯度差，保證了高效分離。因此可以加大電場強(qiáng)度，達(dá)到100～200V/cm，全面提高分離質(zhì)量。

　　毛細(xì)管電泳的基本裝置是一根充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管和與毛細(xì)管兩端相連的兩個(gè)小瓶微量樣品從毛細(xì)管的一端通過“壓力”或“電遷移”進(jìn)入毛細(xì)管。電泳時(shí)，與高壓電源連接的兩個(gè)電極分別浸人毛細(xì)管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷極性相反的電極方向泳動(dòng)。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點(diǎn)等性質(zhì)的不同而遷移速率不同，依次移動(dòng)至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測(cè)器，檢測(cè)、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)將各組分以吸收峰的形式動(dòng)態(tài)直觀地記錄下來。