MicroRNA(miRNA)熒光定量PCR原理
一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRN As 。
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRN As 。
二、miRNA是如何產(chǎn)生的？（
ri圖一： Micro RNA 的產(chǎn)生
miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個 核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不完全互補(bǔ)的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因，而幾個 miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個 miRNA 來經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
三、miRNA熒光定量PCR基本原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實(shí)時(shí)檢測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ�、靈敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA，長度太短，并不能通過傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測,但是通過特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針可以精確檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平，也可以用終點(diǎn)PCR法定性檢測。
圖一 miRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理
雖然 microRNA 實(shí)時(shí)定量PCR是一種最近才發(fā)展起來的檢測技術(shù)，其技術(shù)細(xì)節(jié)還在不斷完善中,但是microRNA 實(shí)時(shí)定量PCR檢測系統(tǒng)，相對其它microRNA檢測技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：
1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進(jìn)行定量，有效區(qū)分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；
2.快速，簡單，省時(shí)，整個操作只需兩步，不到 3 個小時(shí)，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)；
3.檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；
4.超寬的線性范圍，可跨越 7 個數(shù)量級；
圖二 人的腦（ B ），心臟（ H ）和肝臟（ R ）組織中 microRNA 表達(dá)情況：分別采用實(shí)時(shí)定量 PCR ，終點(diǎn)法 PCR 和 Northern Blot 檢測， RNA 用量和時(shí)間見圖。
四、miRNA序列在線查找
參考文獻(xiàn)
1.Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.Methods 2001, 25:402-408.
2.L D Ke, Z Chen .A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards Mol Cell Probes. 2000 Apr;14(2):127-35.
3.Weihong Liu and David A. Saint Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics Biochemical and Biophysical Research Communications 294 (2002) 347–353
4.Caifu Chen, Dana A. Ridzon, Adam J.Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT–PCR.Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20
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