限制酶使用說(shuō)明

瀏覽次數(shù)：5185　發(fā)布日期：2009-1-21　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、分類(lèi)

目前，已被發(fā)現(xiàn)的限制酶，根據(jù)其反應(yīng)的必須因子和切斷點(diǎn)等特性，被分為以下三大類(lèi)：

類(lèi) 別	反應(yīng)必須因子	切點(diǎn)	酶例
I 型	s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg²⁺	識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，切斷部位不定	EcoB、EcoK
II 型	Mg²⁺	切斷識(shí)別部位或其附近的特定部位	EcoR I、BamH I
III 型	ATP、Mg²⁺	識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位	EcoP I、Hinf III

應(yīng)用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II類(lèi)酶，現(xiàn)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售的酶都屬于II類(lèi)酶, 這些限制酶由于其反應(yīng)條件和底物DNA種類(lèi)的不同，其切斷狀況及出現(xiàn)Star活性的頻率等各有不同，并且其程度也根據(jù)酶的不同而千差萬(wàn)別。因而在使用限制酶時(shí)，必須對(duì)這些要素充分注意，確保目標(biāo)序列的切斷反應(yīng)能順利進(jìn)行，下面具體介紹一下使用限制酶時(shí)的一些注意點(diǎn)。

二、注意事項(xiàng)

1. 甲基化的影響

從帶有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制備的DNA，其堿基的一部分已經(jīng)被甲基化，因此即便使用能夠識(shí)別、切斷被甲基化部分的序列的限制酶，也幾乎無(wú)法切斷被甲基化的部分。被甲基化的部位，根據(jù)底物DNA及宿主種類(lèi)的不同而不同。例如宿主菌為大腸桿菌的情況下，根據(jù)宿主的種類(lèi)有以下兩種情況：

在進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，通常使用的菌株為C600、HB101、JM109等，因?yàn)槎紟в衐am、dcm甲基化酶，所以使用這些菌株制備的DNA時(shí)，必須注意。另外，動(dòng)物由來(lái)的DNA，CG序列多為^5mCG；植物由來(lái)的DNA，CG及CNG序列多為^5mCG和^5mCNG。

2. Star活性

限制酶在一些特定條件下使用時(shí)，對(duì)于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來(lái)識(shí)別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷，這個(gè)現(xiàn)象叫Star活性。Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同，可以說(shuō)幾乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它們除了識(shí)別序列的范圍增大之外，還發(fā)現(xiàn)了在DNA的一條鏈上加入切口的單鏈切口活性，所以為了極力抑制Star活性，一般情況下，即使會(huì)降低反應(yīng)性能，我們也提倡在低甘油濃度、中性pH、高鹽濃度條件下進(jìn)行反應(yīng)。

3. 部分分解

如果使用預(yù)計(jì)的限制酶對(duì)底物DNA進(jìn)行作用，而未能完全將其切斷，其原因除了上述兩點(diǎn)和酶失活之外，DNA的純度、反應(yīng)阻害物的影響、DNA的種類(lèi)等也有關(guān)系。特別是由于DNA種類(lèi)不同，它們的大小、切點(diǎn)數(shù)也不同，達(dá)到完全分解時(shí)，所需要的酶量也不同，從這些數(shù)據(jù)中計(jì)算出的 [完全分解1 μg DNA所需要的限制酶預(yù)計(jì)量] 與 [實(shí)際量]，也因限制酶的種類(lèi)不同而有差別，這些差別被認(rèn)為是酶同其識(shí)別位點(diǎn)周?chē)母呒?jí)結(jié)構(gòu)親和程度而產(chǎn)生的。例如，限制酶Nae I 在切斷pBR322 DNA時(shí)，就有著非常難以切斷的部位。另外，因反應(yīng)液組成變化 (如添加精脒)，也可以使切斷順序發(fā)生變化。

4. DNA結(jié)合物質(zhì)

限制酶切反應(yīng)后進(jìn)行電泳時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生電泳帶無(wú)法確認(rèn)、電泳帶擴(kuò)散、電泳帶移動(dòng)距離異常等問(wèn)題，這是由于酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起，使DNA沒(méi)有進(jìn)入電泳凝膠中，或DNA難以被溴乙錠染色而造成的。發(fā)生這些現(xiàn)象時(shí)，在試樣中加入一些蛋白質(zhì)變性劑 (如SDS，終濃度0.1%左右)，便可改善電泳效果。

5. 其它

限制酶的保質(zhì)期一般是在檢定日以后的三年內(nèi)，但幾乎所有的限制酶在超過(guò)保質(zhì)期后都不會(huì)急劇失活，因此購(gòu)入后即使是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間保存的酶，也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測(cè)一次活性。另外，保存酶時(shí)即便讓其凍結(jié)，大部分酶也不會(huì)急劇失活。

三、活性定義

限制酶的一個(gè)活性單位 (1 U)，原則上是在50 μl的反應(yīng)液中，37℃的溫度條件下，經(jīng)過(guò)1小時(shí)反應(yīng)，將1 μg DNA完全分解所需要的酶量。關(guān)于測(cè)定活性用的底物DNA以及溫度，在后面的資料中對(duì)每種酶都做了詳細(xì)介紹。此外酶在其它通用緩沖液中的相對(duì)活性，在附表中也有總括記載。

四、純度檢定

每個(gè)批號(hào)的酶基本上都要進(jìn)行下列項(xiàng)目的檢測(cè)：

1. 過(guò)剩量酶反應(yīng)檢定

在1 μg底物DNA(通常用λDNA)中加入過(guò)量的限制酶，反應(yīng)24小時(shí)，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，根據(jù)電泳圖譜，判斷酶中是否夾雜有非特異性核酸酶。

2. 基因組DNA分析

對(duì)指定的限制酶(在酶的分項(xiàng)介紹中標(biāo)明)進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)。在適當(dāng)?shù)募?xì)菌DNA底物中 (瓊脂糖凝膠塊中的DNA濃度為0.5 μg/50 μl)加入20～150 U的限制酶，反應(yīng)24小時(shí)，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，根據(jù)電泳圖譜，確認(rèn)酶中是否含有雜質(zhì)。

3. 連接—再切檢定

把底物DNA首先與2~50倍過(guò)量的酶反應(yīng)，然后回收切斷后的DNA，把它溶解于T4 DNA連接酶的緩沖液中 [66 mM Tris-HCI (pH7.6)，6.6 mM MgCl2，10 mM DTT，0.4 mM ATP] 使其5’ 末端濃度成為0.1~1.0 μM，加入適量的T4 DNA連接酶，在16℃下反應(yīng)1小時(shí)或16~18小時(shí)，再回收DNA后，把它溶解于限制酶反應(yīng)液中，用同樣的限制酶再進(jìn)行切斷反應(yīng)。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以判斷是否存在連接酶抑制劑或磷酸酶以及核酸外切酶等雜質(zhì)。

4. pKF3克隆檢測(cè)

對(duì)于在強(qiáng)制克隆載體pKF3 DNA的多克隆位點(diǎn)上有一個(gè)切斷點(diǎn)的限制酶，可以進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)。用10倍過(guò)量的被檢測(cè)的限制酶對(duì)pKF3 DNA進(jìn)行作用，失活處理后，將已切斷的DNA用DNA連接試劑盒在16℃、30 min的條件下進(jìn)行反應(yīng)，將該反應(yīng)液的一部分轉(zhuǎn)化到TH2感受態(tài)細(xì)胞中，用兩種培養(yǎng)基 (LB-Cm-Sm、LB-Cm) 在37℃的條件下培養(yǎng)兩個(gè)晚上，根據(jù)LB-Cm-Sm培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)菌落，來(lái)判斷限制酶中是否含有極其微量的核酸外切酶。

五、甲基化的影響

如果限制酶識(shí)別序列中的堿基被甲基化，則根據(jù)被甲基化堿基的種類(lèi)及位置的不同，有時(shí)會(huì)發(fā)生該DNA切不開(kāi)的現(xiàn)象。

大多數(shù)大腸桿菌都帶有2種具有特異性識(shí)別位點(diǎn)的甲基化酶，即dam methylase (G^6mATC) 和dcm methylase (C^5mCWGG)，因此，從這些大腸桿菌中提取的DNA，該序列一般被甲基化。
另外，哺乳類(lèi)由來(lái)的DNA，大多受CG methylase (^5mCG) 的影響而被甲基化。

受dam methylase、dcm methylase、CG methylase影響的限制酶，在酶的單項(xiàng)介紹中都做了提示，希望在使用中加以注意。

六、Star活性

限制酶根據(jù)反應(yīng)條件的不同，可能會(huì)切斷與原來(lái)認(rèn)識(shí)序列不同的位點(diǎn)，這種不同于原有的特異性的活性，稱(chēng)為Star活性，在各種酶的分項(xiàng)介紹中，我們將容易產(chǎn)生Star活性的酶，以及產(chǎn)生的條件做了注明。

七、雙酶切反應(yīng)

使用兩種酶同時(shí)進(jìn)行DNA切斷反應(yīng) (Double Digestion)，是實(shí)驗(yàn)操作中常用的手段之一。此時(shí)，使用Buffer非常重要。在"Double Digestion(雙酶切反應(yīng))時(shí)Universal Buffer(通用緩沖液)的使用表 "中，介紹了雙酶切反應(yīng)的Buffer系統(tǒng)，供實(shí)驗(yàn)參考之用。

八、PCR片段末端的限制酶切斷

PCR片段經(jīng)酶切后克隆于載體中是經(jīng)常使用的實(shí)驗(yàn)方法。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。在"PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點(diǎn)的切斷情況 "中，介紹了PCR片段末端的限制酶切斷情況。

九、限制酶末端的相互連接

盡管限制酶不同，但只要酶切后產(chǎn)生的切口序列相互吻合，就可以進(jìn)行相互連接。"有關(guān)Ligation和Recutting的限制酶一覽表 "中羅列了這些限制酶的相互關(guān)系，對(duì)選擇用于切斷－連接的限制酶很有用處。

十、保存溫度

-20℃下保存。

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