電泳技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
自從1946年瑞典物理化學(xué)家Tiselius教授研制的第一臺(tái)商品化移界電泳系統(tǒng)問世以來,在近半個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間里,電泳技術(shù)發(fā)展極其迅速�；陔娪驹淼母鞣N儀器設(shè)備不斷問世,特別是20世紀(jì)80年代后, 許多自動(dòng)化電泳儀器相繼為臨床實(shí)驗(yàn)室所采用,電泳技術(shù)已成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重要工具之一。 目前,該技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、有機(jī)物、無機(jī)離子等的分離和鑒定,甚至病毒與細(xì)胞的研究。特別是電泳所用支持介質(zhì)由流動(dòng)相改為固相支持物后,各種各樣的電泳分析裝置不斷推出以適應(yīng)不同教學(xué)、臨床和科研工作的需要。當(dāng)今,電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用在后基因組學(xué)研究中,正發(fā)揮者著巨大的作用,為臨床檢驗(yàn)的發(fā)展帶來新的生機(jī)與活力。
一、電泳分析儀
電泳分析儀可分為兩大類:臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)類,如全自動(dòng)熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀、全自動(dòng)醋纖膜電泳儀、全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀和全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀;科研為主兼做臨床樣本類,如雙向電泳及雙向電泳2液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳2質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管芯片電泳、DNA測(cè)序系統(tǒng)。
1. 全自動(dòng)熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀:具有熒光/可見光雙系統(tǒng),在使用熒光試劑項(xiàng)目如肌酸激酶(CK) 、乳酸脫氫酶(LD)同工酶時(shí)為全自動(dòng)。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后,操作人員可離機(jī)完成試驗(yàn)并得到結(jié)果,此為全自動(dòng)電泳儀。但是使用可見光項(xiàng)目如蛋白電泳,中途人員需返回,將電泳膠片由電泳槽放入染色系統(tǒng)中才可完成試驗(yàn)。而最大優(yōu)點(diǎn)是熒光系統(tǒng)全自動(dòng)且靈敏度高,準(zhǔn)確度高并且采用高壓、低溫系統(tǒng),只需要20 min即可完成電泳分析,速度非�？�。
2. 全自動(dòng)醋纖膜電泳儀:為可見光單系統(tǒng),使用醋纖膜電泳片。自動(dòng)化程度高,只需將樣品、試劑、電泳片放好,人員可離機(jī)完成試驗(yàn)得到結(jié)果。但是因?yàn)槭褂么桌w膜致使靈敏度低,無法分析尿蛋白/腦脊液蛋白,對(duì)同工酶分析效果也不理想,多半實(shí)驗(yàn)室只用于血清蛋白電泳分析。
3. 全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀:為可見光單系統(tǒng),使用瓊脂糖凝膠電泳膠片。優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高,可使用于低濃度蛋白檢驗(yàn),如尿蛋白及腦脊液蛋白。而同工酶的分離效果也相當(dāng)不錯(cuò)。但缺點(diǎn)為自動(dòng)化程度較差,當(dāng)電泳結(jié)束和染色脫色完成后,工作人員必須將電泳片由機(jī)器中取出,對(duì)實(shí)驗(yàn)室較為麻煩。但是因?yàn)檫@類儀器所能做項(xiàng)目比較多,且靈敏度較高仍為許多實(shí)驗(yàn)室所接受。
4. 全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng):集上述儀器的優(yōu)點(diǎn),自動(dòng)點(diǎn)樣、電泳、呈色(或染色、脫色) 、烘干�？捎酶鞣N電泳片,包括瓊脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等,采用可見光及熒光呈色雙系統(tǒng),是一種較理想的電泳儀。
5. 雙向電泳及雙向電泳2液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用:雙向電泳第一向?yàn)榈入娋劢?第二向?yàn)樘荻仁榛撬徕c( SDS)電泳。樣品經(jīng)過電荷與質(zhì)量兩次分離后可得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息,這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高,信息量最多的技術(shù),已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。自1975年,O′Farrel等建立這種技術(shù)后,已有許多改進(jìn),使得這一技術(shù)日趨完善。ISO2DALT系統(tǒng)的第一向是用管狀凝膠,雖然分辨率高、上樣量大、耐高鹽等優(yōu)點(diǎn),但有陰極漂移而丟失堿性蛋白、載體兩性電解質(zhì)pH梯度不穩(wěn)定、受電場和時(shí)間影響而重復(fù)性不好等缺點(diǎn)。20世紀(jì)80年代后期, Gorg等將固相pH梯度等電聚焦技術(shù)用作雙向電泳的第一向,稱為IPG2DALT。固相pH梯度等電聚焦沒有陰極漂移, pH梯度穩(wěn)定,分辨率高,重復(fù)性好,是目前流行的雙向電泳技術(shù)。與傳統(tǒng)的單向電泳方法最多只能分析100種蛋白質(zhì)樣品相比,雙向電泳最多可分析5 000 ～ 10 000個(gè)蛋白點(diǎn)的圖譜。雙向電泳在分離蛋白混合樣品,比較差異方面有不可替代的作用。當(dāng)發(fā)現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)時(shí),將其切下再用液相色譜分離,與質(zhì)譜聯(lián)用,最后可鑒定新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組分。
6. 高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳2質(zhì)譜聯(lián)用:高效毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場為推動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。利用毛細(xì)管代替平板凝膠,分離效率得以提高。高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍從小分子、無機(jī)離子到生物大分子,甚至整個(gè)細(xì)胞,從帶電粒子到中性分子都可用高效毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行分析。目前,毛細(xì)管與質(zhì)譜的接口難題已經(jīng)解決,人們能利用毛細(xì)管電泳的高效分離能力與質(zhì)譜的鑒定技術(shù)聯(lián)用發(fā)揮其特殊功能,發(fā)現(xiàn)未知的化合物。尤其是陣列毛細(xì)管電泳儀已經(jīng)問世,這將克服目前大多數(shù)商品化毛細(xì)管電泳儀只能進(jìn)行單根毛細(xì)管電泳的缺陷,這種高通量的新方法將會(huì)給后基因組時(shí)代的基因分析帶來革命性的變化。
7. 毛細(xì)管電泳芯片:利用毛細(xì)管電泳芯片可以進(jìn)行DNA長度、序列和基因分型等分析,在臨床檢測(cè),尤其在遺傳病的診斷中具有重要意義�，F(xiàn)在分離DNA,是利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸,整個(gè)分離過程在45 s之內(nèi),而芯片的長度僅為318 cm。因?yàn)槠淇沙休d高電壓(2 300 V / cm)并具有較小的樣品體積,故有利于得到較好的分離效果。而用傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳分離技術(shù)分離DNA樣品,通常需要10～30 min,電壓也只能加到500 V / cm。另外有人制作的用于高速DNA分離的芯片,有效長度僅為315 cm,分離從70～1 000bp的DNA 片斷,時(shí)間在120 s以內(nèi)。目前,高速、高通量的毛細(xì)管電泳芯片已經(jīng)發(fā)展得比較完善。2002年筆者曾在瑞典召開的第十五屆國際微量分離與分析會(huì)議上見到Caliper公司設(shè)計(jì)的DNA電泳芯片,即在一個(gè)光盤大小的芯片上有96個(gè)毛細(xì)管電泳陣列,分別與96個(gè)樣品池相連,呈輻射狀,并采用一個(gè)旋轉(zhuǎn)的共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。此系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)96個(gè)不同的樣品進(jìn)行分離,分離檢測(cè)過程在8 min以內(nèi)。
8. DNA測(cè)序系統(tǒng):該系統(tǒng)利用凝膠毛細(xì)管的原理,將多道毛細(xì)管陣列設(shè)計(jì),用4種不同的熒光染色標(biāo)記4種核苷酸,在模板上合成DNA單鏈,然后在DNA外切酶的作用下進(jìn)行堿基的連續(xù)水解和釋放,用激光識(shí)別和記錄釋放的堿基�？捎糜贒NA序列測(cè)定,雜合子自動(dòng)檢測(cè),點(diǎn)突變分析,等位基因鑒定, SNP篩查,雜合性缺失檢測(cè),AFLP指紋圖譜,微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性分析,基因表達(dá),測(cè)序質(zhì)量評(píng)估,序列比較等。20世紀(jì)90年代中期,測(cè)序儀重大改進(jìn),集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳。2001年完成人類基因組框架圖提前完成得益于多通道、集束化的毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)的出現(xiàn)。目前,在我國已有少數(shù)醫(yī)院開始采用8 通道的DNA測(cè)序,系統(tǒng)開展用拉米夫定治療乙型肝炎病毒(HBV)的YMDD突變檢測(cè)。
二、電泳技術(shù)臨床應(yīng)用
隨著新的電泳技術(shù)的出現(xiàn),各種自動(dòng)化電泳分析儀問世并相繼被引入臨床實(shí)驗(yàn)室,電泳技術(shù)在臨床疾病的診斷中正發(fā)揮越來越多的作用,特別是為各種體液蛋白質(zhì)、同工酶等的檢測(cè)提供了新的手段。
1. 血清蛋白電泳:新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后,常見白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5條帶。血清蛋白質(zhì)電冰圖譜是了解患者血清蛋白質(zhì)全貌的有價(jià)值的方法,可用為初篩試驗(yàn)。急性炎癥或急性時(shí)相反應(yīng)時(shí)常以α1、α2 區(qū)帶加深為特征;妊娠型α1 區(qū)帶增高,伴有β區(qū)帶增高;腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時(shí)呈現(xiàn)白蛋白下降,α1、β球蛋白升高;缺鐵性貧血時(shí)可由于轉(zhuǎn)鐵蛋白的升高而呈現(xiàn)β區(qū)帶增高,而慢性肝病或肝硬化呈現(xiàn)白蛋白顯著降低,γ球蛋白升高2～3倍,示免疫球蛋白( Ig)多克隆高,甚至可見β～γ橋,還可在γ區(qū)呈現(xiàn)細(xì)而密的寡克隆區(qū)帶;單克隆Ig異常癥(M蛋白血癥)則在電冰區(qū)帶α～γ區(qū)呈現(xiàn)致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生區(qū)帶(M蛋白區(qū)帶) 。
2. 尿蛋白電泳:尿蛋白電泳的主要目的是在無損傷的情況下,協(xié)助臨床判斷腎臟病變的嚴(yán)重程度。當(dāng)不能進(jìn)行腎活檢時(shí),尿蛋白電泳結(jié)果能很好地協(xié)助臨床判斷腎臟的主要損害。尿蛋白電泳后呈現(xiàn)出中、高分子蛋白區(qū)帶主要反映腎小球病變,呈現(xiàn)出低分子蛋白區(qū)帶可見于腎小管病變或溢出性蛋白尿(如本周蛋白) ;混合性蛋白尿可見到各種分子量區(qū)帶,示腎小球和腎小管均受累及。對(duì)臨床癥狀不典型的患者及微量蛋白尿患者的診斷及各種腎臟疾病治療過程中病情的動(dòng)態(tài)分析也具有很大價(jià)值。
3. 腦脊液蛋白電泳:若在腦脊液(CSF)標(biāo)本中檢出寡克隆區(qū)帶,而其相應(yīng)血標(biāo)本中未能檢出區(qū)帶,反映是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身合成的Ig,具有重要臨床意義。但為保證正確的比較與分析,須將患者血清和CSF在同一天同步進(jìn)行分析,以論證不同來源的Ig。中樞合成Ig是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的一個(gè)重要信號(hào),主要用于多發(fā)性硬化癥、癡呆、脊髓炎、亞急性腦白質(zhì)炎、神經(jīng)性梅毒等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的診斷和鑒別診斷。
4. 血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳:應(yīng)用電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量對(duì)于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。HbA2 增高是β2輕型地中海貧血的一個(gè)重要特征, HbA2 減低見于缺鐵性貧血及其他Hb合成障礙性疾病(常見如α2地中海貧血) 。電泳發(fā)現(xiàn)異常Hb如HbC、HbD、HbE、HbK和HbS等則可診斷為相應(yīng)的Hb分子病。在酸性條件下電泳,可將糖化血紅蛋白的不同組分HbA1 a, HbA1 b和HbA1 c分離開來, HbA1 c形成與RBC內(nèi)葡萄糖有關(guān),可特異性反映測(cè)定前6 ～ 8周體內(nèi)葡萄糖水平。此外,糖化血紅蛋白可對(duì)某些患者因HbF增高所造成HbA1 c假性升高作出解釋。
5. 免疫固定電泳:可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型,最常用于臨床常規(guī)M蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆Ig增殖病、單克隆Ig病、本周蛋白和游離輕鏈病、多組分單克隆Ig病、重鏈病、CSF寡克隆蛋白鑒別、多克隆Ig病的診斷和鑒別診斷。
6. 同工酶電泳:臨床上用于同工酶或同工酶亞型分析。(1)乳酸脫氫酶(LD /LDH)同工酶:用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)法可分離出5種同工酶區(qū)帶(LD1 ～LD5 ) 。主要用于急性心肌梗死(LD1 >LD2 )及骨骼肌疾病(LD5 升高)的診斷和鑒別診斷。惡性腫瘤、肝硬化時(shí)可見LD5 明顯升高,或在胸腹水中出現(xiàn)一條異常LD6區(qū)帶。(2)肌酸激酶(CK)同工酶:采用AGE法可分離出3種CK同工酶。當(dāng)出現(xiàn)異常同工酶如巨肌酸激酶1 (CK1 ) 、巨CK2 等時(shí),從電泳圖譜上很容易發(fā)現(xiàn)。CK2MB在心肌梗死早期增加和短時(shí)間內(nèi)達(dá)峰值也是心肌再灌注的指征。CK2BB增高見于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌和胃腸道惡性腫瘤,后者還常有CK2Mt增高。 (3) CK同工酶亞型:指CK2MM亞型(CK2MM1、CK2MM2、CK2MM3 )和CK2MB亞型(CK2MB1、CK2MB2 ) ,常采用瓊脂糖凝膠IEF或高壓電泳。采用瓊脂糖凝膠高壓電泳可進(jìn)行CK同工酶亞型的常規(guī)快速分析,用于臨床早期心肌損傷的臨床診斷與鑒別診斷。主要用于急性心肌梗死的早期診斷,也可用于確定心肌再灌注、溶栓治療后的病情觀察。(4)堿性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用AGE法進(jìn)行ALP同工酶的常規(guī)快速分析。肝外阻塞性黃疸、轉(zhuǎn)移性肝癌、肝膿瘍和膽石癥時(shí)膽汁ALP檢出率很高,并伴有肝ALP增加,而肝內(nèi)膽汁淤積、急性肝炎、原發(fā)性肝癌等主要表現(xiàn)為肝ALP增多,大多數(shù)不出現(xiàn)膽汁ALP。甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、骨折、肢端肥大癥所致骨損傷等,均引起骨ALP同工酶增加。骨ALP、高分子ALP同工酶對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的陽性預(yù)示值較總ALP高。胃腸道腫瘤、肺癌等惡性腫瘤時(shí)出現(xiàn)類腸型ALP。(5)γ2谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ2GT/GGT)同工酶:用CAE或AGE法可將γ2GT同工酶分離為γ2GT1 ～γ2GT4 ,正常人只見γ2GT2 和γ2GT3 ,重癥肝膽疾病和肝癌時(shí)常有γ2GT1 出現(xiàn),γ2GT4 與膽紅素增高密切相關(guān)。
7. 脂蛋白電泳:脂蛋白電泳檢測(cè)各種脂蛋白(包括膽固醇和TG)主要用于高脂血癥的分型、冠心病危險(xiǎn)性估計(jì),以及動(dòng)脈粥樣硬化性及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療(包括治療性生活方式改變、飲食及調(diào)脂藥物治療)效果觀察的研究等。
三、現(xiàn)狀與展望
我國在電泳技術(shù)臨床應(yīng)用上與國外相比,存在明顯差距。對(duì)于電泳項(xiàng)目,國內(nèi)一般以血清蛋白為主,而國外所做項(xiàng)目包括血清蛋白、尿蛋白、CK、LD、ALP、GGT同工酶、各種脂蛋白的膽固醇/甘油三酯等。對(duì)于電泳試劑,歐美這幾年均以瓊脂糖凝膠電泳片占95%以上,國內(nèi)仍有40%市場采用醋纖膜電泳片。分析這些差距,有主觀因素,也有客觀原因。目前國內(nèi)有不少臨床實(shí)驗(yàn)室仍采用較落后的電泳設(shè)備或手工電泳方法,既不能及時(shí)、準(zhǔn)確獲得分析結(jié)果,也使得許多新的檢驗(yàn)項(xiàng)目不能開展并應(yīng)用于臨床常規(guī)分析,影響了臨床相關(guān)疾病的診治和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。也有一些較大規(guī)模的醫(yī)院,雖然購置了先進(jìn)的自動(dòng)化電泳系統(tǒng),但由于宣傳介紹不夠,臨床醫(yī)生對(duì)電泳檢測(cè)項(xiàng)目了解少而不開檢驗(yàn)申請(qǐng)單。
從目前臨床實(shí)驗(yàn)室的要求來看電泳儀必須具有下列功能:
(1)全自動(dòng):必須達(dá)到人員離機(jī)作業(yè),由點(diǎn)樣到出報(bào)告沒有人工動(dòng)作。
(2)速度快:所有項(xiàng)目應(yīng)在60 min內(nèi)完成同時(shí)具備急診項(xiàng)目如CK、LD等同工酶及亞型項(xiàng)目。
(3)項(xiàng)目全:除了血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、CK、LD同工酶等傳統(tǒng)項(xiàng)目外必須還能完成尿蛋白、腦脊液蛋白、免疫固定(單克隆抗體) 、ALP和GGT同工酶、膽固醇(高密度/極低密度/低密度脂蛋白) 、脂蛋白( a)等最新檢驗(yàn)項(xiàng)目。
(4)敏感度高:必須采用敏感度高的電泳片。如瓊脂糖凝膠系統(tǒng),才能得到準(zhǔn)確度高,分辨率高的電泳結(jié)果。
