發(fā)酵過程染菌及其防治

    發(fā)酵染菌：指在發(fā)酵過程中生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵系統(tǒng)，從而使發(fā)酵過程失去真正意義上的純種培養(yǎng)。

     染菌對發(fā)酵的影響

1、青霉素發(fā)酵過程：由于許多雜菌都能產(chǎn)生青霉素酶，因此不管染菌是發(fā)生在發(fā)酵前期、中期或后期，都會使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。

2、核苷或核苷酸發(fā)酵過程：由于所用的生產(chǎn)菌種是多種營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成。

3、檸檬酸等有機酸發(fā)酵過程：一般在產(chǎn)酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會發(fā)生染菌，主要是要預(yù)防發(fā)酵前期染菌。

4、谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發(fā)酵的影響較大。

二、染菌發(fā)生的不同時間對發(fā)酵的影響

1、種子培養(yǎng)期染菌

種子培養(yǎng)主要是使微生物細胞生長與繁殖，此時，微生物菌體濃度低，培養(yǎng)基地營養(yǎng)十分豐富，比較容易染菌。

若將污染的種子帶入發(fā)酵罐，則危害極大，因此應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌的發(fā)生。

一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌的污染，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。

2、發(fā)酵前期染菌

在發(fā)酵前期，微生物菌體主要是處于生長、繁殖階段，此時期代謝的產(chǎn)物很少，相對而言這個時期也容易染菌。

染菌后的雜菌將迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的正常生長、繁殖及產(chǎn)物的生成。

3、發(fā)酵中期染菌

發(fā)酵中期染菌將會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，并嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。

有的染菌后雜菌大量繁殖，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌體自溶，致使發(fā)酵液發(fā)粘，產(chǎn)生大量的泡沫，代謝產(chǎn)物的積累減少或停止；

有的染菌后會使已生成的產(chǎn)物被利用或破壞。

從目前的情況來看，發(fā)酵中期染菌一般較難挽救，危害性較大，在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡力做到早發(fā)現(xiàn)、快處理。

4、發(fā)酵后期染菌

由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的糖等營養(yǎng)物質(zhì)已接近耗盡，且發(fā)酵的產(chǎn)物也已積累較多，如果染菌量不太多，對發(fā)酵影響相對來說就要小一些，可繼續(xù)進行發(fā)酵。

對發(fā)酵產(chǎn)物來說，發(fā)酵后期染菌對不同的產(chǎn)物的影響也是不同的，如抗生素、檸檬酸的發(fā)酵，染菌對產(chǎn)物的影響不大；肌苷酸、谷氨酸等地發(fā)酵，后期染菌也會影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、提取和產(chǎn)品的質(zhì)量。

發(fā)酵異常現(xiàn)象及原因分析

發(fā)酵過程中的種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異�，F(xiàn)象是指發(fā)酵過程中某些物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生與原有規(guī)律不同的改變，這些改變必然影響發(fā)酵水平，使生產(chǎn)蒙受損失。對此應(yīng)及時查明原因，加以解決。

一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異常現(xiàn)象

1、種子培養(yǎng)異常（表現(xiàn)為培養(yǎng)的種子質(zhì)量不合格）：菌體生長緩慢；菌絲結(jié)團；代謝不正常。

2、發(fā)酵異常：菌體生長差；pH值過高或過低；溶解氧水平異常；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；菌體生長差。

二、染菌的檢查和判斷

發(fā)酵過程是否染菌應(yīng)以無菌試驗的結(jié)果為依據(jù)進行判斷。

在發(fā)酵過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失的重要手段。因此，生產(chǎn)上要求能準(zhǔn)確、迅速的檢查出雜菌的污染。

目前常用于檢查是否染菌的無菌試驗方法主要有：顯微鏡檢查法、肉湯培養(yǎng)法、平板（雙碟）培養(yǎng)法、發(fā)酵過程的異常觀察法（如溶氧量）等。

此法檢查雜菌最簡單、最直接、最常用。必要時還可進行芽胞染色或鞭毛染色。

1、顯微鏡檢查法（鏡檢法）

用革蘭氏染色法（Grams stain）對樣品進行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征進行區(qū)別、判斷是否染菌。如發(fā)現(xiàn)有與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其它微生物的存在，就可判斷為發(fā)生了染菌。

2、肉湯培養(yǎng)法（用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，同時此法也可用于噬菌體的檢查）

通常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待測樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37℃、27℃進行培養(yǎng)，隨時觀察微生物的生長情況，并取樣進行鏡檢，判斷是否有雜菌。

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基配方：0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、0.8％蛋白胨、0.4％酚紅溶液，pH 7.2。

3、平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法

將待測樣品在無菌平板上劃線，分別于37℃、27℃進行培養(yǎng)，一般24h后即可進行鏡檢觀察，檢查是否有雜菌。有時為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可將需要檢查的樣品先置于37℃培養(yǎng)6h，使雜菌迅速增殖后再劃線培養(yǎng)。

4、注意點

無菌試驗時，如果肉湯連續(xù)三次發(fā)生變色反應(yīng)（紅色→黃色）或產(chǎn)生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌；

有時肉湯培養(yǎng)的陽性反應(yīng)不夠明顯，而發(fā)酵樣品的各項參數(shù)確有可疑染菌，并經(jīng)鏡檢等其它方法確認連續(xù)三次樣品有相同類型的異常菌存在，也應(yīng)該判斷為染菌；

一般來講，無菌試驗的肉湯或培養(yǎng)平板應(yīng)保存并觀察至本批（罐）放罐后12h，確認為無雜菌后才能棄去；

無菌試驗期間應(yīng)每6h觀察一次無菌試驗樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。

三、發(fā)酵染菌原因分析

1、染菌的雜菌種類分析

2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析

大批量發(fā)酵罐染菌：

染菌時期	原因
發(fā)酵前期	種子帶菌、連消設(shè)備染菌
發(fā)酵中、后期	如雜菌類型相同，一般是空氣凈化系統(tǒng)存在空氣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不合理、空氣過濾介質(zhì)失效等問題

 

 

 

 部分發(fā)酵罐染菌：

染菌時期	原因
發(fā)酵前期	種子帶菌、連消系統(tǒng)滅菌不徹底
發(fā)酵后期	中間補料染菌，如補料液帶菌、補料管滲漏

 

 

 

      個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌（如果采用間歇滅菌工藝，一般不會發(fā)生）：大都由于設(shè)備滲漏造成，應(yīng)仔細檢查閥門、罐體或罐器是否清潔等。

3、不同污染時間分析

A、染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌。通常是由種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素等原因而引起染菌。

B、在發(fā)酵過程的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌。大部分也是由于種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素、無菌空氣等原因而引起。

C、發(fā)酵后期染菌大部分是由空氣過濾不徹底、中間補料染菌、設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題而引起。

     雜菌污染的預(yù)防

一、種子帶菌及其防治

1、保藏斜面試管菌種染菌、培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、種子轉(zhuǎn)移和接種過程染菌、種子培養(yǎng)所涉及的設(shè)備和裝置染菌。

2、嚴(yán)格控制無菌室的污染，根據(jù)生產(chǎn)工藝的要求和特點，建立相應(yīng)的無菌室，交替使用各種滅菌手段對無菌室進行處理；在制備種子時對砂土管、斜面、三角瓶及搖瓶均嚴(yán)格進行管理，防止雜菌的進入而受到污染。為了防止染菌，種子保存管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，且有一定的長度，保存溫度盡量保持相對穩(wěn)定，不宜有太大變化；對每一級種子的培養(yǎng)物均應(yīng)進行嚴(yán)格的無菌檢查，確保任何一級種子均未受雜菌污染后才能使用；對菌種培養(yǎng)基或器具進行嚴(yán)格的滅菌處理，保證在利用滅菌鍋進行滅菌前，先完全排除鍋內(nèi)的空氣，以免造成假壓，使滅菌的溫度達不到預(yù)定值，造成滅菌不徹底而使種子染菌。

二、空氣帶菌及其防治

要杜絕無菌空氣帶菌，就必須從空氣的凈化工藝和設(shè)備的設(shè)計、過濾介質(zhì)的選用和裝填、過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。

1、加強生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生管理，減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣的含菌量，正確選擇采氣口，如提高采氣口的位置或前置粗過濾器，加強空氣壓縮前的預(yù)處理，如提高空壓機進口空氣的潔凈度。

2、設(shè)計合理的空氣預(yù)處理工藝，盡可能減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣帶油、水量，提高進入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對濕度，保持過濾介質(zhì)的干燥狀態(tài)，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進入空氣系統(tǒng)等。

3、設(shè)計和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質(zhì)，在過濾器滅菌時要防止過濾介質(zhì)被沖翻而造成短路，避免過濾介質(zhì)烤焦或著火，防止過濾介質(zhì)的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質(zhì)充填密度。當(dāng)突然停止進空氣時，要防止發(fā)酵液倒流入空氣過濾器，在操作中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。

三、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治

1、通常對于淀粉質(zhì)培養(yǎng)基地滅菌采用實罐滅菌較好，一般在升溫前先通過攪拌混合均勻，并加入一定量的淀粉酶進行液化；有大顆粒存在時應(yīng)先經(jīng)過篩除去，再行滅菌；對于麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多的培養(yǎng)基，采用罐外預(yù)先配料，再轉(zhuǎn)至發(fā)酵罐內(nèi)進行實罐滅菌較為有效。

2、在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過并驅(qū)除罐內(nèi)冷空氣，一般可避免“假壓”造成染菌。

3、要嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫的大量產(chǎn)生。

4、避免蒸汽壓力的波動過大，應(yīng)嚴(yán)格控制滅菌溫度，過程最好采用自動控溫。

5、發(fā)酵過程越來越多的采用自動控制，一些控制儀器逐漸被應(yīng)用。一般常采用化學(xué)試劑浸泡等方法來滅菌。

四、設(shè)備滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

設(shè)備滲漏主要是指發(fā)酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，由于化學(xué)腐蝕（發(fā)酵代謝所產(chǎn)生的有機酸等發(fā)生腐蝕作用）、電化學(xué)腐蝕、磨蝕、加工制作不良等原因形成微小漏孔后發(fā)生滲漏染菌。

染菌的挽救和處理

一、種子培養(yǎng)期染菌的處理

1、一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌污染，該種子不能再接入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄之，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。

2、采用備用種子，選擇生長生產(chǎn)無染菌的種子接入發(fā)酵罐，繼續(xù)進行發(fā)酵生產(chǎn)。

3、如無備用種子，則可選擇一個適當(dāng)菌齡的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液作為種子，進行“倒種”處理，接入新鮮的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，從而保證發(fā)酵生產(chǎn)的正常進行。

二、發(fā)酵前期染菌的處理

1、當(dāng)發(fā)酵前期發(fā)生染菌后，如培養(yǎng)基中的碳、氮源含量還比較高時，終止發(fā)酵，將培養(yǎng)基加熱至規(guī)定溫度，重新進行滅菌處理后，再接入種子進行發(fā)酵；

2、如果此時染菌已造成較大的危害，培養(yǎng)基中的碳、氮源的消耗量已比較多，則可放掉部分料液，補充新鮮的培養(yǎng)基，重新進行滅菌處理后，再接種進行發(fā)酵。

3、也可采取降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)pH值、調(diào)整補料量、補加培養(yǎng)基等措施進行處理。

三、發(fā)酵中、后期染菌處理

1、發(fā)酵中、后期染菌或發(fā)酵前期輕微染菌而發(fā)現(xiàn)較晚時，可以加入適當(dāng)?shù)貧⒕鷦┗蚩股�素以及正常的發(fā)酵液，以抑制雜菌的生長速度，也可采取降低培養(yǎng)溫度、降低通風(fēng)量、停止攪拌、少量補糖等其它措施，進行處理。

2、如果發(fā)酵過程的產(chǎn)物代謝已達到一定水平，此時產(chǎn)品的含量若達一定值，只要明確是染菌也可放罐。

3、對于沒有提取價值得發(fā)酵液，廢棄前應(yīng)加熱至120℃以上、保持30min后才能排放。

四、染菌后對設(shè)備的處理

染菌后的發(fā)酵罐在重新使用前，必須在放罐后進行徹底清洗，空罐加熱滅菌至120℃以上、保持30min后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法進行處理。

      噬菌體污染及其防治

一、癥狀：發(fā)酵液光密度不上升或回降；pH值逐漸上升；氨利用停止；糖耗、溫升緩慢或停止；產(chǎn)生大量泡沫，使發(fā)酵液呈粘膠狀；鏡檢時菌體數(shù)量顯著減少，甚至找不到完整菌體；發(fā)酵周期延長、產(chǎn)物生成量減少或停止等。

二、根源：環(huán)境污染噬菌體是造成噬菌體感染的主要根源。

三、防治：嚴(yán)禁活菌體排放，切斷噬菌體的“根源”；做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌；嚴(yán)防噬菌體與雜菌進入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi)；抑制罐內(nèi)噬菌體的生長；輪換使用菌種或使用抗性菌株。

四、挽救措施

1、盡快提取產(chǎn)品

2、藥物抵抗（如四環(huán)素可抵抗乳糖桿菌噬菌體；吐溫60等表面活性劑可抑制噬菌體的增殖和吸附）

3、罐內(nèi)滅噬菌體法（60-70℃，5min可滅活）