細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的操作模式

    動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器操作模式，一般分為分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半連續(xù)式操作（semi-continuous）、連續(xù)式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五種操作模式。 
1. 批式操作（batch culture）
    批式操作是動(dòng)物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。 
    該方式的特點(diǎn):(1) 操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制，因此操作簡(jiǎn)單，容易掌握；(2)直觀的反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程。 由于培養(yǎng)期間細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分,因此可直觀的反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程,是動(dòng)物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；(3)可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)�？蛇_(dá)12000L。
    分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)分為五個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。分批培養(yǎng)的周期時(shí)間多在3~5天，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48~72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。 
    經(jīng)過改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器，目前仍是大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用以生產(chǎn)各種藥物的主要設(shè)備，也是早期用以生產(chǎn)單抗的主要途徑。在用攪拌式生物反應(yīng)器分批式培養(yǎng)單抗中，最多采用的是微囊或巨載體培養(yǎng)。與一般的懸浮培養(yǎng)比較，雜交瘤細(xì)胞依托微囊化或巨載體后，相對(duì)固定化，降低了攪拌培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞的剪切力，提高了細(xì)胞的密度和穩(wěn)定性及生產(chǎn)率。在1986年以前，采用此種方式培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞就有100多種。
2. 流加式操作（fed-batch culture）
    流加式操作是在批式操作的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2 ～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。
流加培養(yǎng)主要有以下特點(diǎn)：
1） 流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，流加的速率通常與消耗的速率相同，根據(jù)測(cè)得的底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，以保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。
2） 培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。
3） 流加培養(yǎng)過程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。
4） 在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。
    流加培養(yǎng)工藝是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，也是近年來動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)�？梢蕴砑右淮�，也可添加多次，為了追求更高的細(xì)胞密度往往需要添加一次以上，直至細(xì)胞密度不再提高；可進(jìn)行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進(jìn)行添加，但為了盡可能的維持相對(duì)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成分即不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。
流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分主要分為三大類：
1） 葡萄糖。葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
2） 谷氨酰胺。谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
3） 氨基酸、維生素及其他。主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵進(jìn)行緩慢連續(xù)流加。
流加式操作分為兩種類型：?jiǎn)我谎a(bǔ)料分批式操作和反復(fù)補(bǔ)料分批式操作。
1） 單一補(bǔ)料分批式操作是在培養(yǎng)開始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。
2） 反復(fù)補(bǔ)料分批式操作是在單一補(bǔ)料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個(gè)一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。
3.半連續(xù)式操作（semi-continuous culture）、重復(fù)批式操作（repeated batch culture）、換液操作（medium change culture） 半連續(xù)式操作又稱為重復(fù)分批式操作或換液操作。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。
    這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/2~3/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加�；蛘咴诩�(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。 
    半連續(xù)式操作的特點(diǎn)為：1）培養(yǎng)物的體積逐步增加；2）可進(jìn)行多次收獲；3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。
該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。
4. 連續(xù)式操作（continuous culture）
    連續(xù)式操作是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；與此同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。連續(xù)培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除，細(xì)胞活性高最終細(xì)胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。此外，連續(xù)式操作還有一些不足，如：1）由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染；2）在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；3）對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。
    連續(xù)式操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。
   連續(xù)式操作的特點(diǎn)為：1）細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)；2）產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)；3）可控制衰退期與下降期。
5. 灌流式操作（perfusion culture）
    灌流式操作是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。
    灌流式操作常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。
    中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。
    另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。
    灌流式操作的共同優(yōu)點(diǎn)是：①細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；②連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；③反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；④產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。連續(xù)灌注培養(yǎng)法是近年來用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體，以及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種操作方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等