細(xì)菌感染性疾病的直接核酸診斷試驗(yàn)

                 Florence Paillard, PhD, and Craig S. Hill, PhD

準(zhǔn)確和快速的診斷是及時(shí)采取治療措施和防止感染性疾病擴(kuò)散的關(guān)鍵。理想的感染性疾病的診斷試劑應(yīng)該能夠給臨床醫(yī)生提供快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)試劑如果靈敏度不高則可能導(dǎo)致疾病的漏檢，使患者不能得到及時(shí)的治療，還可造成疾病的擴(kuò)散；同樣，試劑如果特異性較差則可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，假陽性的出現(xiàn)不僅會(huì)導(dǎo)致不必要的治療，還可能給人們帶來心理上的陰影。不論對(duì)個(gè)人還是公共衛(wèi)生部門，因檢測(cè)方法的不可靠所導(dǎo)致的錯(cuò)誤診斷都有可能造成嚴(yán)重的后果。令人欣慰的是，近年來分子診斷技術(shù)的發(fā)展已使得人們可以研制出比傳統(tǒng)方法更為靈敏、特異和快速的用于感染性疾病的診斷試劑。

一、細(xì)菌感染性疾病診斷方法述評(píng)

數(shù)十年來，檢測(cè)細(xì)菌的的標(biāo)準(zhǔn)方法是培養(yǎng)（液體和/或固體培養(yǎng)基）和染色，如用于結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色和淋病奈瑟菌的革蘭染色。其它一些方法還包括采用抗體技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌抗原的酶免疫測(cè)定（EIA）和直接熒光抗體技術(shù)（DFA）等。

采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)微生物核酸成分的核酸檢測(cè)（NATs）技術(shù)的發(fā)展為臨床診斷方法帶來了革命性的變化。目前用于微生物鑒定的NATs主要有兩種類型：培養(yǎng)確認(rèn)檢測(cè)試劑和直接檢測(cè)試劑。培養(yǎng)確認(rèn)的NATs試劑主要用來對(duì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行確認(rèn)；直接NATs試劑可以直接檢測(cè)標(biāo)本中的微生物，無需培養(yǎng)。與培養(yǎng)確認(rèn)探針試劑相比，由于直接NATs試劑完全不需要培養(yǎng)這一步驟，所以可以更快地給出檢測(cè)結(jié)果；直接NATs試劑一般來說其準(zhǔn)確性也高于直接免疫檢測(cè)方法。美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)非放射性直接NATs試劑是Gen-Probe PACE試劑，用來檢測(cè)衣原體和淋球菌感染。

對(duì)直接NATs試劑而言，一個(gè)至關(guān)重要的改進(jìn)在于加入了目標(biāo)擴(kuò)增步驟，即探針檢測(cè)前將目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。第一個(gè)用于沙眼衣原體檢測(cè)的核酸擴(kuò)增試劑（NAATs）于1993年獲得了FDA的批準(zhǔn)。此后，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的不斷改進(jìn)，出現(xiàn)了可以將樣品成分的抑制作用降為最小的第二代NAATs，它的操作流程也得到了相應(yīng)改進(jìn)。

本文將就已經(jīng)商品化并得到FDA批準(zhǔn)的用于檢測(cè)五種細(xì)菌感染的直接NATs試劑進(jìn)行述評(píng)。這五種感染為：鏈球菌性咽炎、肺結(jié)核（TB）、陰道炎、衣原體（CT）和淋球菌（GC）感染。

二、直接NAT方法學(xué)

非擴(kuò)增直接NATs（表1）：大多數(shù)商品化的直接NATs試劑都采用特異性針對(duì)出現(xiàn)在被測(cè)生物體內(nèi)的一段獨(dú)有的核酸序列（目標(biāo)序列）的核酸探針。這種探針通常采用熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。所測(cè)樣品需進(jìn)行處理以使其能夠釋放出核酸。檢測(cè)時(shí)，標(biāo)記的DNA探針可以和靶序列特異性結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的探針-目標(biāo)序列雜交體。該雜交體被從非雜交探針中分離或區(qū)別開后，標(biāo)記物散發(fā)出信號(hào)。

在直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中的微生物時(shí)，NATs可以采用不同的方式來提高試劑的靈敏度。Gen-Probe采用的一項(xiàng)專利技術(shù)是將rRNA作為檢測(cè)目標(biāo)，rRNA在大多數(shù)微生物體內(nèi)是以數(shù)以千計(jì)的拷貝量存在的。例如，沙眼衣原體中的rRNA可達(dá)2000拷貝，而DNA中有用的靶序列在每個(gè)細(xì)菌體內(nèi)的量?jī)H有一個(gè)或數(shù)個(gè)拷貝。因此以rRNA為檢測(cè)目標(biāo)可以大大提高試劑的靈敏度。除此之外，Gen-Probe由于在雜交檢測(cè)中還采用了雜交保護(hù)檢測(cè)（HPA）方法，使其試劑的靈敏度得以進(jìn)一步提高。檢測(cè)rRNA和HPA技術(shù)的結(jié)合使得第一個(gè)DNA探針檢測(cè)試劑被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛用于培養(yǎng)的確定和直接檢測(cè)。

第二個(gè)用于提高DNA探針檢測(cè)靈敏度的方法是對(duì)信號(hào)分子進(jìn)行放大，如雜交捕獲試劑（Hybrid Capture assay）。它采用針對(duì)RNA:DNA雜交體的抗體來檢測(cè)雜交形成，每個(gè)抗體都帶有酶標(biāo)記物。每個(gè)酶分子都會(huì)產(chǎn)生多種著色分子用于與之結(jié)合的每個(gè)雜交分子。這種從一個(gè)雜交分子產(chǎn)生多重信號(hào)分子的方法稱為“信號(hào)放大”方法。但與第三種改進(jìn)試劑性能的“目標(biāo)擴(kuò)增”方法相比，信號(hào)放大方法的靈敏度和特異性都要低的多。

目標(biāo)擴(kuò)增直接核酸擴(kuò)增檢測(cè)（表1）：目標(biāo)擴(kuò)增是指通過在一個(gè)試管內(nèi)產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)目標(biāo)序列拷貝的方法來提高試劑的靈敏度，這種方法類似于通過培養(yǎng)使細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生更多的靶DNA或RNA拷貝以提高檢測(cè)的靈敏度。但靶擴(kuò)增的過程要比培養(yǎng)快的多，它可以用來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室里難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的細(xì)菌。目標(biāo)擴(kuò)增所采用的復(fù)制序列（亦稱amplicons）為標(biāo)記的DNA探針。目前廣泛采用的鑒定細(xì)菌的幾種目標(biāo)擴(kuò)增方法分別為PCR、鏈替代擴(kuò)增（SDA）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）。

1．PCR：指DNA目標(biāo)序列受熱變性，然后加入DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增的過程�？膳c目標(biāo)序列特異性結(jié)合的引物引導(dǎo)DNA聚合酶對(duì)該序列進(jìn)行復(fù)制。DNA合成的每個(gè)過程均經(jīng)歷加熱變性—退火—延伸這樣一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)后拷貝數(shù)可增加一倍。由于反應(yīng)循環(huán)可進(jìn)行一定次數(shù)，所以短時(shí)間內(nèi)即可擴(kuò)增獲得大量目標(biāo)DNA。

2．SDA：與PCR不同，SDA的擴(kuò)增過程是在同一溫度下進(jìn)行的。這種“恒溫”方法也需使用引物來保證擴(kuò)增的DNA序列的特異性。不同的是，它無需采用加熱變性的方法來解鏈雙鏈DNA，而是采用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)新合成的DNA引物進(jìn)行切割。DNA聚合酶能識(shí)別切割位點(diǎn)并可以在該點(diǎn)重新啟動(dòng)DNA合成，通過對(duì)DNA的復(fù)制以替代以前的DNA鏈。這一過程可以使DNA的拷貝成倍增長(zhǎng)，并循環(huán)進(jìn)行。和PCR一樣，SDA僅擴(kuò)增DNA。如果擴(kuò)增對(duì)象是RNA，則需首先將其轉(zhuǎn)錄為DNA。均相檢測(cè)采用出現(xiàn)在SDA反應(yīng)中的稱之為“分子燈標(biāo)”的一種特異性熒光探針，這種探針與擴(kuò)增反應(yīng)過程產(chǎn)生的復(fù)制序列（amplicon）進(jìn)行雜交并改變其結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。

3．TMA：TMA是在恒溫過程中特異性擴(kuò)增RNA或DNA分子，反應(yīng)過程需引物和兩種酶：逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和RNA聚合酶。逆轉(zhuǎn)錄酶用來合成DNA，合成的DNA再被RNA聚合酶用來復(fù)制更多的RNA，這一過程可以循環(huán)進(jìn)行。采用自動(dòng)化擴(kuò)增儀，TMA可以在15到30分鐘內(nèi)使目標(biāo)序列擴(kuò)增100億倍。檢測(cè)采用HPA方法。HPA使用可以和復(fù)制序列進(jìn)行特異性雜交的吖啶酯標(biāo)記探針。擴(kuò)增后，一種“選擇試劑”可以破壞掉未雜交探針上的吖啶酯，而已經(jīng)雜交的探針上的吖啶酯不會(huì)受影響，這是因?yàn)殡s交結(jié)構(gòu)可以保護(hù)它。檢測(cè)可采用發(fā)光儀。

表1.用于細(xì)菌檢測(cè)的商品化直接NAT技術(shù)

NAT類型        技術(shù)         核酸       標(biāo)記        生產(chǎn)商

            雜交保護(hù)（HPA）  rRNA     化學(xué)發(fā)光     Gen-Probe Inc

非靶擴(kuò)增    固相捕獲          rRNA     比色         BD

            雜交捕獲          DNA      化學(xué)發(fā)光     Digene Corp.

           

            PCR               DNA      比色        Roche

靶擴(kuò)增      SDA               DNA      熒光        BD

            TMA              rRNA     化學(xué)發(fā)光    Gen-Probe Inc

三、直接NATs與培養(yǎng)/免疫方法的比較

（一）、與其它常用微生物檢測(cè)方法相比，直接NATs的優(yōu)勢(shì)主要有：

1． 檢測(cè)時(shí)間短（1—6小時(shí)）。雖然這一檢測(cè)時(shí)間與EIA相似，但較之培養(yǎng)所需的24—72小時(shí)甚至8周（如結(jié)核桿菌）而言，還是有很顯著的改進(jìn)�？焖贆z測(cè)不僅可以使病人得到及時(shí)治療，在某些情況下，還能提高公共衛(wèi)生的安全性（如避免疾病的擴(kuò)散）。

2． 高通量檢測(cè)。一些直接NATs可以在同一個(gè)時(shí)間里進(jìn)行幾百個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)，不僅省時(shí)、也降低了成本。自動(dòng)化的直接NATs也大大減輕了工作負(fù)擔(dān)。

3． 高靈敏度NAATs。NAATs理論上可以從每份標(biāo)本中檢出一個(gè)生物體，而其它方法如EIA的最低檢測(cè)水平為每份標(biāo)本1000個(gè)以上的生物體。NAATs的臨床靈敏度一般在95%以上，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法相等或更敏感，在某些標(biāo)本中更是明顯（如尿標(biāo)本CT檢測(cè)）。

4． 因?yàn)闊o須要求被檢測(cè)標(biāo)本中的微生物一定是存活的，所以直接NATs對(duì)標(biāo)本的要求不高。與培養(yǎng)相比，直接NATs所用的標(biāo)本可以放置更長(zhǎng)時(shí)間。

（二）、直接NATs的潛在局限性主要有：

1． 一些第一代NAATs在某種情況下會(huì)因?yàn)閿U(kuò)增抑制作用而導(dǎo)致試劑靈敏度的降低（如采用尿標(biāo)本檢測(cè)CT）。這種抑制作用通常是標(biāo)本-特異的，會(huì)引起假陰性結(jié)果。通過內(nèi)在監(jiān)控或擴(kuò)增控制等方法可以控制這種抑制作用，也可以采用目標(biāo)捕獲等技術(shù)處理標(biāo)本從而消除抑制作用。盡管有時(shí)會(huì)出現(xiàn)抑制作用，但大多數(shù)NAATs臨床檢測(cè)靈敏度仍然高于非擴(kuò)增的直接NATs或EIA。

2． 標(biāo)本之間復(fù)制序列的殘留物污染對(duì)NAATs可能是一個(gè)問題，但不影響非擴(kuò)增直接NATs。嚴(yán)格執(zhí)行操作程序可以最大限度的減少殘留物污染所帶來的影響。

3． 目前FDA批準(zhǔn)的NAATs不能用于檢測(cè)耐藥性。對(duì)于需要了解耐藥情況的一些病例如結(jié)核診斷，需同時(shí)進(jìn)行NAAT和培養(yǎng)。NAATs可以快速檢定結(jié)核桿菌，使患者得到及時(shí)治療；而培養(yǎng)可以確定診斷及細(xì)菌耐藥情況。

4． NAATs的成本通常高于傳統(tǒng)微生物和EIA檢測(cè)方法。一個(gè)例外是CT培養(yǎng)，它一般很難進(jìn)行，而且成本要高于NAATs。

四、用于細(xì)菌感染性疾病的直接NATs（表2）

表２. FDA批準(zhǔn)的用于細(xì)菌感染性疾病的直接NATs

病名　　　病原體　　　生產(chǎn)商/試劑　　 　 檢測(cè)技術(shù)　　　所用標(biāo)本（FDA認(rèn)可）

　　A群鏈球　A群鏈球菌　　Gen-Probe/           HPA         咽拭子標(biāo)本

菌性咽炎　　　　　　　　GASDirect

                             Roche/                           呼吸道標(biāo)本

                             AMPLICOR MTB    PCR        （涂片陽性）

肺結(jié)核     結(jié)核桿菌     Gen-Probe/                        呼吸道標(biāo)本

                        AMPLIFIED（MTD） TMA       （涂片陽性、陰性）

     

                                                     宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                        Gen-Probe, PACE 2 CT  HPA      男性尿道拭子標(biāo)本

                                                    眼結(jié)膜拭子標(biāo)本

   衣原體感染  沙眼衣原體   Digene,Hybrid          Hybrid

                             Capture II CT         Capture    宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                                              宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                             Roche,AMPLICOR CT  PCR      男性尿道拭子標(biāo)本

                                                              男性和女性尿標(biāo)本

                                                               宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                                                 男性尿道拭子標(biāo)本

                              Gen-Probe,APTIMA Combo 2 TMA   男性和女性尿標(biāo)本

                                                                 陰道拭子

                              Gen-Probe, PACE 2 GC  HPA       宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                                                男性尿道拭子標(biāo)本

                               Digene,Hybrid          Hybrid     

                               Capture II GC          Capture    宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                                                 宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                Roche,AMPLICOR GC  PCR      男性尿道拭子標(biāo)本

       淋球菌感染  淋病奈瑟菌                                    男性尿液

                                                                 宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                BDProbe Tec ET CT/GC   SDA    男性尿道拭子標(biāo)本

                                                                 男性和女性尿標(biāo)本

                                                                 宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本

                                Gen-Probe,APTIMA Combo 2 TMA  男性尿道拭子標(biāo)本

                                                                  男性和女性尿標(biāo)本

                                                                  陰道拭子

                  陰道加特納菌、

       陰道炎     陰道毛滴蟲、   BD Affirm VPIII            固相   陰道拭子

                  念珠菌屬                                  捕獲

    A群鏈球菌性咽炎：檢測(cè)咽炎病人A群鏈球菌（GAS）的金標(biāo)準(zhǔn)是采用咽拭子標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，但培養(yǎng)需要24—48小時(shí)。目前所開發(fā)的快速抗原檢測(cè)試劑（RADT）雖然可以進(jìn)行快速檢測(cè)，而且使用也較方便，但其靈敏度一般比培養(yǎng)低。許多專家建議當(dāng)病人為兒童或青少年、或醫(yī)生在他的實(shí)際工作中不能確定所使用的RADT的靈敏度是否和培養(yǎng)相同時(shí)，則應(yīng)當(dāng)采用咽拭子培養(yǎng)對(duì)所有RADT檢測(cè)陰性的標(biāo)本進(jìn)行確定。

Gen-Probe公司生產(chǎn)的GASDirect試劑（表2）是目前唯一通過FDA認(rèn)可的用于檢測(cè)GAS的直接NAT試劑。它采用HPA方法測(cè)定GAS的rRNA序列。GASDirect的靈敏度約為90%、特異性≥98%，優(yōu)于RADT試劑，與培養(yǎng)的靈敏度相似。GASDirect的檢測(cè)時(shí)間為60分鐘，每份標(biāo)本的檢測(cè)成本低于咽拭子培養(yǎng)，與RADT相同。因此，在GAS的檢測(cè)方法中，GASDirect不失為一個(gè)有用的選擇。

肺結(jié)核（TB）：目前美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和CDC對(duì)TB的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求是熒光抗酸染色（AFB涂片）和液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。涂片比較快捷但靈敏度較低；培養(yǎng)的靈敏度較高但需2到8周。Gen-Probe公司生產(chǎn)的AMPLIFIED結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑（MTD、第一個(gè)由FDA批準(zhǔn)的結(jié)核NAAT檢測(cè)試劑）和Roche公司的AMPLICOR MTB試劑（表2）已被用于TB的診斷。不過這兩種試劑被限定只能用于呼吸道標(biāo)本的檢測(cè)。它們可以用做TB的初期診斷，但不能用于監(jiān)控治療。

    與培養(yǎng)或最終確診結(jié)果相比，上述方法的靈敏度和特異性與培養(yǎng)相似，但這些商品化的NAAT試劑的檢測(cè)時(shí)間只需一天，因此可以為醫(yī)生提供快速診斷結(jié)果。FDA早期批準(zhǔn)的NAAT試劑僅用于AFB涂片陽性的病人，而后來批準(zhǔn)的MTD試劑可以用來對(duì)涂片陰性的可疑TB患者進(jìn)行檢測(cè)。MTD這一用途使其能夠?qū)��?biāo)本中結(jié)核桿菌數(shù)量很少而難以采用涂片檢查的病人進(jìn)行快速檢測(cè)。圖1概述了CDC推薦的采用MTD檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的使用原則。

圖1. 用于可疑TB患者的MTD檢測(cè)使用原則

        第一份痰標(biāo)本 → 培養(yǎng) → 確定或否定TB診斷

         ↓      ↓

        涂片   NAAT

         ↓      ↓

        陽性    陽性 → MTB陽性

        陽性    陰性 → 檢查有無抑制作用 → 無 → 檢測(cè)其它標(biāo)本 → 涂片（+）MTD（–）→NTM

                                         → 有 → 采用MTD或其它NAAT檢測(cè)其它標(biāo)本

        陰性    陽性 → 檢測(cè)其它標(biāo)本 → MTD（+）→ MTB陽性

        陰性    陰性 → 檢測(cè)其它標(biāo)本 → 涂片（–）MTD（–）→ MTB陰性

       

        注：NTM：非結(jié)核分枝桿菌。

陰道炎：與陰道炎有關(guān)的微生物包括陰道加特納菌、陰道毛滴蟲和念珠菌屬。傳統(tǒng)診斷陰道炎的方法為陰道標(biāo)本培養(yǎng)和玻片鏡檢。培養(yǎng)雖然靈敏，但耗時(shí)、耗力，且成本較高；玻片鏡檢比較快捷，但對(duì)某些病原體的靈敏度較低（如檢測(cè)念珠菌和滴蟲的靈敏度≤55%），且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性常常依靠操作人員的經(jīng)驗(yàn)。BD公司的Affirm VPIII檢測(cè)試劑（表2）是一種NAT試劑，采用兩個(gè)探針：一個(gè)是捕獲探針，一個(gè)為檢測(cè)探針。靶序列首先與固定在一個(gè)珠子上的捕獲探針進(jìn)行雜交，然后再與檢測(cè)探針雜交。隨后經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的標(biāo)本和探針，將檢測(cè)探針與檢測(cè)酶結(jié)合。通過幾次洗滌將多余的酶去除后再加入酶底物，結(jié)果呈藍(lán)色，可通過肉眼觀察。Affirm VPIII能檢測(cè)上述三種病原體，與培養(yǎng)相比，其靈敏度分別為：念珠菌81%、加特納菌89%、毛滴蟲92%。

衣原體（CT）和淋球菌（GC）感染：檢測(cè)CT和GC的實(shí)驗(yàn)室方法目前主要包括革蘭染色、培養(yǎng)、非擴(kuò)增NATs、NAATs、EIA和DFA。

1．非擴(kuò)增NATs：Gen-Probe公司生產(chǎn)的檢測(cè)CT、GC或聯(lián)檢DNA探針試劑（PACE 2 CT、PACE 2 GC或PACE 2C）已獲得FDA的批準(zhǔn)，可用來檢測(cè)來自宮頸內(nèi)、男性尿道和眼結(jié)膜（僅供CT）的標(biāo)本。使用一份拭子標(biāo)本，PACE2就可以對(duì)CT和GC進(jìn)行聯(lián)檢（PACE 2C）或檢測(cè)其中的一種。目前在美國(guó)PACE2系列已成為臨床實(shí)驗(yàn)室最為常用的檢測(cè)CT和GC的方法。PACE 2采用HPA方法測(cè)定rRNA，靈敏度和特異性與培養(yǎng)相似；PACE 2 GC的靈敏度與NAATs相似，但PACE 2 CT的靈敏度低于NAATs（表３）。

表３.�。捶NFDA批準(zhǔn)的檢測(cè)CT直接NATs對(duì)比

　　試劑　　　　　　技術(shù)　　靶序列　　拭子標(biāo)本的靈敏度　　尿標(biāo)本的靈敏度

　Gen-Probe PACE 2 CT　HPA　　rRNA　　　70%--90%            不適用

　Roche AMPLICOR CT  PCR    DNA       >90%                80%--90%

  BD Probe Tec CT/GC    SDA    DNA       >90%                80%--90%

  Gen-Probe APTIMA

   Combo 2 CT/GC        TMA   rRNA      >95%                >90%

2．NAATs：Roche公司的AMPLICOR試劑是第一代基于PCR的NAAT；而BD公司的BDProbe Tec是第一代基于SDA的NAAT。這些試劑擴(kuò)增的目標(biāo)序列通常位于染色體DNA或質(zhì)粒中。BDProbe Tec目前有兩種：一是檢測(cè)CT的BDProbe Tec CT，另一種是可以在一份標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)CT和GC的BDProbe Tec CT/GC。新近出現(xiàn)的CT/GC NAAT是Gen-Probe公司的Combo 2試劑，它是基于TMA的第二代NAAT，通過在一份標(biāo)本中同時(shí)擴(kuò)增CT和GC的rRNA分子而對(duì)二者進(jìn)行檢測(cè)和確定。這種試劑采用一種獨(dú)特的目標(biāo)捕獲方法對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行純化和濃縮以去除可能存在于標(biāo)本內(nèi)的抑制物。目標(biāo)捕獲方法采用特異性探針將目標(biāo)rRNA分子結(jié)合到磁微粒上，未結(jié)合的分子經(jīng)洗滌除去。隨后已經(jīng)過純化和濃縮后的目標(biāo)分子通過TMA進(jìn)行擴(kuò)增。

3．檢測(cè)CT和GC的直接NATs的靈敏度和特異性：檢測(cè)CT的NAATs通常比非擴(kuò)增的NATs和CT培養(yǎng)的靈敏度高，而檢測(cè)GC的NAATs的靈敏度與培養(yǎng)和非擴(kuò)增的NATs相似。采用拭子標(biāo)本的所有檢測(cè)CT的NAATs一般都有較高的靈敏度(>90%)，其中Combo 2試劑的靈敏度最高（>90%）。

對(duì)于泌尿生殖道標(biāo)本，PACE 2試劑盒被批準(zhǔn)只可采用男性尿道和女性宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本檢測(cè)CT和GC。而NAATs不僅可以采用拭子標(biāo)本、也可使用尿液標(biāo)本。由于尿的采集是非侵入性的，易于被病人接受，同時(shí)也減輕了工作負(fù)擔(dān)。由于高水平抑制物質(zhì)的存在，采用尿標(biāo)本的第一代NAATs的靈敏度比采用拭子標(biāo)本低5-10%，這點(diǎn)在女性更為明顯。采用PCR方法（如AMPLICOR試劑）檢測(cè)女性尿標(biāo)本中GC的效果尚不清楚。SDA方法已獲批準(zhǔn)可以采用男性和女性尿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，但女性尿標(biāo)本檢測(cè)靈敏度比宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本低大約10%。Combo 2靶捕獲方法可以減少抑制，因此采用該試劑檢測(cè)尿標(biāo)本的靈敏度高達(dá)91%-100%。

CDC最近發(fā)表了CT和GC檢測(cè)指南（表4）。NAATs因其高靈敏度被推薦用于CT檢測(cè)，但也可采用探針檢測(cè)和EIA方法。對(duì)于GC檢測(cè)應(yīng)首選拭子標(biāo)本培養(yǎng)，因其具有很高的靈敏度，并能進(jìn)行藥敏檢測(cè)。NAATs和探針檢測(cè)的靈敏度與GC培養(yǎng)相似，當(dāng)因轉(zhuǎn)送和儲(chǔ)存條件不佳難以進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)推薦采用NAATs和探針檢測(cè)。不論CT還是GC感染，所有檢測(cè)方法均推薦采用男性尿道和女性宮頸內(nèi)拭子標(biāo)本。如果侵入性的拭子采集方法不被接受或不能采集，NAATs可采用尿標(biāo)本。由于交叉污染或某些第一代NAATs可以和非淋病奈瑟菌發(fā)生非特異性反應(yīng)，CDC建議核查一些陽性結(jié)果以排除假陽性。在低流行人群中，對(duì)CT/GC NAAT結(jié)果陽性者應(yīng)進(jìn)行附加NAAT檢測(cè)以排除可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，避免給患者帶來不良影響。陽性結(jié)果的確認(rèn)應(yīng)采用不同的NAAT或采用技術(shù)相同但擴(kuò)增不同CT/GC序列的NAAT，以幫助排除假陽性結(jié)果。

表４.　 CDC推薦篩查男女CT和GC感染的檢測(cè)方法

　　　病原體　　　　　　　　　檢測(cè)方法

　　　　　　　　　　　　　　采用拭子或尿標(biāo)本的NAAT

　　　　　　　　　　　　　　采用拭子標(biāo)本的非擴(kuò)增NAT、EIA

　　　　　衣原體（CT）　　 或DFA

　　　　　　                拭子培養(yǎng)

                            拭子培養(yǎng)

　　　　　淋球菌（GC）     采用拭子標(biāo)本的NAAT

                            或非擴(kuò)增NAT

                            采用尿標(biāo)本的NAAT

五、直接NATs的未來發(fā)展趨勢(shì)

提升自動(dòng)化程度使操作更容易是直接NATs的未來發(fā)展趨勢(shì)之一�，F(xiàn)行的直接NAT儀器大多只能自動(dòng)化操作檢測(cè)過程中的一部分（如擴(kuò)增或測(cè)定）。新的全自動(dòng)儀器如TIGRIS DTS（Gen-Probe公司）可以自動(dòng)化完成所有檢測(cè)步驟，每12小時(shí)最多可進(jìn)行1000個(gè)測(cè)試。

一些以往采用繁雜、冗長(zhǎng)檢測(cè)方法的NAATs正開始使用測(cè)定擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的復(fù)制序列的探針（實(shí)時(shí)檢測(cè)）。實(shí)時(shí)擴(kuò)增技術(shù)尤其適用于定量檢測(cè)。

多元化檢測(cè)也是未來發(fā)展的一個(gè)方向，它可以用一項(xiàng)檢測(cè)來測(cè)定多個(gè)病原體。相信擴(kuò)增技術(shù)、生物芯片和微流體技術(shù)的應(yīng)用最終能夠使我們采用一項(xiàng)檢測(cè)、用一份標(biāo)本來檢測(cè)多個(gè)不同的病原體，不僅快捷、而且具有良好的性價(jià)比。

六、結(jié)論

直接NATs代表了檢測(cè)細(xì)菌感染的診斷方法上的一項(xiàng)突破。快捷、精確、采用標(biāo)本靈活使得直接NATs在臨床實(shí)驗(yàn)室的用量持續(xù)增長(zhǎng)。在諸如CT感染等多種細(xì)菌感染的診斷中，直接NATs正在越來越多地替代培養(yǎng)和其它常規(guī)方法。在ＴＢ的診斷中，由于需要區(qū)分不同的分枝桿菌和測(cè)定藥敏，所以NAATs還不能完全取代培養(yǎng)，但NAATs和培養(yǎng)可以取長(zhǎng)補(bǔ)短、聯(lián)合用在ＴＢ的診斷中。用于分枝桿菌的NAATs的未來發(fā)展包括檢測(cè)不同分枝桿菌的多元化測(cè)定和藥敏測(cè)定。更新一代的直接NATs也正在研發(fā)中。

　　七、參考文獻(xiàn)（略）

作者簡(jiǎn)介：Florence Paillard, PhD，美國(guó)科學(xué)和醫(yī)學(xué)專業(yè)作家；Craig S. Hill, PhD，美國(guó)Gen-Probe公司科學(xué)事物主管。