irm-LC/MS: 蜂蜜中糖的δ13C分析同位素質(zhì)譜應(yīng)用報告

Andreas W. Hilkert, Michael Krummen and Dieter Juchelka, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany

關(guān)鍵詞 同位素質(zhì)譜 HPLC 糖 蜂蜜 化合物特定同位素分析 LC IsoLink接口

前言 糖類是生命中最大和最常見的分子 家族。糖類充當(dāng)著能量的來源， DNA和RNA的主要組成部分，生物活性化合物的載體和植物組織結(jié)構(gòu)的建筑材料。糖類能夠攜帶其來源和處理加工過程的信息。如果用同位素標(biāo)記，它可以告訴我們關(guān)于其循環(huán)途徑和新陳代謝情況。 同位素質(zhì)譜的應(yīng)用是建立在對自然界中發(fā)生的物理和生化同位素分餾所產(chǎn)生的化合物中同位素間的最小差異的分析基礎(chǔ)之上的。用同位素質(zhì)譜儀所作的同位素示蹤實驗，只須使用極低量的示蹤物質(zhì)（<< 0.1 at%）就可給出糖代謝的途徑和代謝率。超高精度同位素質(zhì)譜甚至能對新陳代謝過程中的天然示蹤物質(zhì)：如C-3化合物中的C-4化合物進(jìn)行分析。C-3和C-4是CO2在植物中固定的兩種途徑的首字母縮寫，這兩種固定途徑導(dǎo)致了碳的 13 C/ 12 C同位素比之差為15‰（δ符號，～0.015at%），高精度同位素質(zhì)譜的測量精度優(yōu)于± 0.2 ‰，與其相比，這已經(jīng)是一個大范圍了。

糖混合物的δ值及重復(fù)性的irm-LC/MS測量結(jié)果

同位素比監(jiān)測-液質(zhì)聯(lián)用儀（irm-LC/MS）包括LC IsoLink接口是分析糖類的可選技術(shù)。既不需要連接氣相色譜，也不需要連接元素分析器（EA）就可完成。 小樣品量復(fù)雜混合物用于做化合物特定同位素分析，無需大量的準(zhǔn)備或衍生化工作。對于irm-LC/MS來說不存在由于糖類乙�；�產(chǎn)生的同位素轉(zhuǎn)移。由于不需要衍生化并減少了準(zhǔn)備的步驟，用irm-LC/MS分析糖類將得到更準(zhǔn)確、更精密和更快速的結(jié)果。 一種新的方法是對水溶液中的總體亞微克級樣品的同位素分析。樣品準(zhǔn)備的容易度、分析速度（<100秒/樣品）和高靈敏度（EA法的100倍）較傳統(tǒng)EA法優(yōu)越得多。

糖混合物的irm-LC/MS色譜圖

irm-LC/MS 色譜條件

irm-LC/MS 技術(shù) LC IsoLink是第一種連接高效液相色譜（HPLC）與同位素比質(zhì)譜的高靈敏度接口，用于重復(fù)并精確地聯(lián)機(jī)測定 13 C/ 12 C同位素比。在保證色譜分辨率的條件下，可分析所有從HPLC色譜柱上洗脫下來的有機(jī)化合物。 在LC IsoLink接口中，樣品在HPLC的洗脫水溶液中被氧化，然后生成的CO 2 從液相中分離出來。這個過程是定量的和自由分離的過程。 氧化物由兩種溶液組成：氧化劑和催化劑。它們分別由泵抽取并加入到流動相中。在該混合物中所有從HPLC色譜柱上洗脫下來的單有機(jī)化合物在通過一個加熱的反應(yīng)爐時被氧化成一定量的CO 2 ，在一個流動方向向下的分離單元中，CO 2 從液相中被去除，然后被嵌入He氣流中，He中的單個CO 2 峰隨即通過一個聯(lián)機(jī)氣體干燥單元（Nafion™）干燥，然后通過一個打開的狹縫接口進(jìn)入同位素比質(zhì)譜。

帶LC IsoLink接口的irm-LC/MS 系統(tǒng)原理圖

摻假 蜂蜜的檢測 蜂蜜是一種高品質(zhì)的天然甜味劑，是由蜜蜂從花蜜或蜜露中生產(chǎn)出來的。植物花蜜主要由葡萄糖和含蔗糖的果糖組成，還含有少量的葡萄糖和果糖的雙糖化合物。這種混合物或者化合物可以用其他來源添加而成以假冒蜂蜜，如高果糖玉米糖漿（四碳糖）。 直到現(xiàn)在，對于用C4糖制作的摻假蜂蜜的檢測是測量蜂蜜的δ 13 C值和與EA法相比得到的它的蛋白質(zhì)百分比。但是這種方法對摻假品的可靠的檢測限是四碳糖添加物的碳含量為7%，另一種技術(shù)是使用HPLC進(jìn)行糖的圖像識別。然而多同位素分析很難檢測低量的C-4糖摻假品，尤其添加了C-3糖的摻假品。 有了HPLC和同位素比質(zhì)譜的結(jié)合便可填補(bǔ)這個空白，蜂蜜中每一種單糖的δ 13 C值都能分析。果糖和葡萄糖的δ 13 C的比值，其他不常見糖類的檢測，還有各種糖樣本的測定都可以在一個單次HPLC操作中確定。 在不同的兩天時間，分兩批次分析了3號蜂蜜的4份相同樣品，結(jié)果證明了irm-LC/MS方法的精密度和可靠度。葡萄糖的平均δ 13 C值為-24.86 ‰ ± 0.05 ‰，果糖的平均值為-24.86 ‰ ± 0.15 ‰，蔗糖隨其他少量化合物洗脫，不用于精密測定。

表1：8個蜂蜜樣品的irm-LC/MS和EA分析結(jié)果

表1所示是用irm-LC/MS和EA分析的8個蜂蜜樣品，以給出天然蜂蜜和摻假蜂蜜的不同情況。EA法可檢測出2個摻假蜂蜜產(chǎn)品，irm-LC/MS法檢測出4個摻假的產(chǎn)品。 峰蜜1的Flu/Glu比值正常，但是由于其很小的負(fù)δ值，超過了-23.5 ‰，仍懷疑為摻假產(chǎn)品。蜂蜜主要成分和蛋白質(zhì)的比較表明有16.7%的摻假率。

蜂蜜1

蜂蜜2顯然為100%的四碳糖。由于蛋白質(zhì)不能沉淀，所以不能用測蛋白質(zhì)法。用irm-LC/MS法可以檢測在蔗糖之前的四分之一的糖，峰面積的Flu/Glu比為0.65，蔗糖和葡萄糖一樣多，果糖的δ 13 C值比葡萄糖還小2.7‰，這最終證明了此蜂蜜為人工制作。

蜂蜜2

蜂蜜5是摻假產(chǎn)品，但是不能用同位素比的方法檢測出來。盡管如此，F(xiàn)lu/Glu比為4.53還是說明了它是人工蜂蜜。

蜂蜜5

蜂蜜8沒有用EA法檢測是因為0.3‰的差（摻加1.5%四碳糖）在該方法的不確定度之內(nèi)。葡萄糖和果糖的δ 13 C差1.3‰清楚地表明該蜂蜜是摻假的。通過比較，F(xiàn)lu/Glu比為2.17還說明添加了含三碳糖的果糖。

用直接循環(huán)注射的 μ-EA 法

LC IsoLink接口使用直接安裝在HPLC色譜柱之后的直接循環(huán)注射器，提供了一種快速分析多種樣品的方法。 多樣品的處理方法與HPLC分離化合物的方法一樣。 這種μ-EA法可用于在如下色譜圖中所示的全部可溶性物質(zhì)的超快多種樣品分析。該方法的優(yōu)點是直接與某一已知δ 13 C值的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，一次分析循環(huán)時間<100秒。 這種相同的技術(shù)也可用在每一次HPLC的運(yùn)行過程中。在分析多樣品的開始或者結(jié)束時，可以注射進(jìn)某些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而幾乎不損失分析時間。 表2是樣品對已知δ 13 C值為-29.9‰的苯甲酸分析的結(jié)果。EA法（表1）和μ-EA法的分析結(jié)果中平均差為 0.5 ‰，這可能是由于所采用的參考間的差異，也可能是因為μ-EA法只分析可溶于水的化合物的原因。

表2 8 種蜂蜜樣品的μ-EA法測量結(jié)果

μ-EA法：多種蜂蜜樣品直接循環(huán)注射分析

相關(guān)產(chǎn)品 ：
DELTA V 同位素質(zhì)譜儀
MAT253 氣體同位素質(zhì)譜儀

參考文獻(xiàn)： (1) Demmelmair H. et al., 1995, J. Pediatr Gastroenterol. Nutr., 21, 31-36 (2) White J.W., 1992, Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 75, 543-548 (3) Földhazzi, G., 1994, Acta Alimentaria, 23, 299-311 感謝APPLICA GmbH，感謝Bremen提供蜂蜜樣品和EA結(jié)果。 δ 13 C表示待測樣品的 13 C/ 12 C同位素比值對標(biāo)準(zhǔn)樣品的 13 C/ 12 C同位素比值的千分差，以保證數(shù)據(jù)的國際互換性。 δ 13 C= (( 13 C/ 12 C) 樣品 / ( 13 C/ 12 C) 標(biāo)準(zhǔn) – 1) × 1000 δ 13 C的粗略估計值與原子百分比除以1000（atom%/1000）相關(guān)