潔凈室質(zhì)量控制及其檢測方面的討論

　　潔凈室對于制藥工業(yè)的重要意義已為人們肯定。生物制品 是制 藥工業(yè)的一部分，對生產(chǎn)廠房有很高的潔凈要求^{［1，2］}。Gilland等曾在市售的 嗜酸乳桿菌產(chǎn)品中，分離到人為污染的短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等^［3］ 。生物制品生產(chǎn)中，尤其是活菌、活疫苗的生產(chǎn)中，經(jīng)常受到不同程度的污染，因此，不僅 需要重視潔凈室的建立，更要重視質(zhì)量控制方法及標準。

　　朝鮮戰(zhàn)爭中，美國發(fā)現(xiàn)大量電子儀器失靈，最后找到了主要原因，是灰塵在作怪，促成了潔 凈技術(shù)的起步。1961年，誕生了世界上最早的潔凈室標準，既美國空軍技術(shù)條令203，1963 年，頒布了國際上最著名的潔凈室標準：美國聯(lián)邦FS209。1966年，頒布了修訂后的209A， 時至1992年，建立了迄今被廣泛采用的209E。國際上為了加強藥品、生物制品質(zhì)量管理規(guī)范 (GMP)，把潔凈室定為必備的生產(chǎn)硬件之一。GMP對廠房、設(shè)備等，明確規(guī)定了相應(yīng)的潔凈要 求，并制訂了有關(guān)標準。

　　1　潔凈室的污染源

　　潔凈室污染源按性質(zhì)可分物理、化學、生物等。直徑在0.001-1000μm的固態(tài)、液態(tài)或二者 的混合物質(zhì)，包括生物粒子和非生物粒子，我們稱為懸浮粒子(airborne particles)。微生 物一般以無生命的粒子作載體而懸浮，以氣溶膠(Aerosol)形式存在于空氣中，1μm以下 者永外懸浮，10μm以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。潔凈室污染可分為外部污染和內(nèi)部污 染。外部污染指大氣塵污染，可以通過光電法測得。內(nèi)部污染，是由人和有關(guān)的物品、設(shè)備 等引起的。人是潔凈室最大的污染源，占90%左右。人和環(huán)境造成了潔凈室的污染，所以在 潔凈室中，人的數(shù)量和活動應(yīng)有特別嚴格的限制。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以 上的含菌粒子，女性為750個以上。穿衣服時，靜止態(tài)發(fā)菌量為10-300個/min·人，行走時 的發(fā)菌量為900-2500個/min·人�？人砸淮伟l(fā)菌量為70-700個/min·人，噴嚏一次為400-60 0個/min·人^{［4，5］}。

　　2　潔凈室質(zhì)控標準

表1　世界主要國家潔凈室標準(潔凈度級別)

　　 潔凈室是指空氣潔凈度達到規(guī)定級別要求的可供人類工作的場所 ，其功能是控制微粒的污染 。一般按用途可分為：1.工業(yè)潔凈室，以無生命的微粒為控制對象；2.生物潔凈室，主要 控制微生物對工作對象的污染。

　　世界主要國家的潔凈室標準見表1^［6，7］。美國是世界上最早頒布潔凈室標準的 國家，各國的潔凈室標準都是在美國標準的基礎(chǔ)上，結(jié)合各國的實際情況而制訂的，我國的 標準基本上參照美國聯(lián)邦標準和歐共體的標準而制訂的。

　　3　潔凈室質(zhì)控的檢測方法及討論^［8］

　　3.1　塵埃粒子　由于空氣中存在大量塵埃粒子，而微生物大多依附于這些塵埃粒子隨空氣流動造成污染。制 藥工業(yè)用多種方法獲得無菌狀態(tài)，過濾法以其捕集率高，又經(jīng)濟而被廣泛使用。其中，特別 應(yīng)該提到的是采用了HEPA(High Eqqicienoy Particulate Air)過濾器，對0.3μm以上空氣 粒子捕集率高達99.97%以上，除濾過病毒外，空氣中所有微生物顆�？杀粸V除。因此， 正常潔凈室是無菌的，但是，由于人、物、環(huán)境等污染因素，潔凈室往往受到不同程度 污染。因此，我們多采用激光塵埃粒子計數(shù)且進行監(jiān)控。標準見表2。

表2　國內(nèi)外有關(guān)懸浮粒子的測定標準(塵粒數(shù)/m³)

　　3.2　空氣微生物　空氣中活微生物大多依附塵埃粒子而形成生物活性粒子。應(yīng)用細菌采樣器抽取一定量的空氣 使其滯留在培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)。早在現(xiàn)代微生物問世之前，人們就認為某些疾 病是由被稱為“瘴氣”的空氣污染而引起。20世紀30年代，英國研制porton液體采樣器，美 國研制了AGI液體采樣器。1941年，Bourdion使用裂縫式采樣器，成為空氣微生物采樣測定 的開端。1956年，報道了第一個篩孔撞擊式采樣器，1958年A.A.Andersn對其加以改進并 定型生產(chǎn)，稱為安德森(Anderson)空氣微生物采樣器。它由頂罩、6節(jié)篩板、3個彈簧及抽氣 孔和動力裝置構(gòu)成。目前，這種采樣器已發(fā)展到8級，并有許多改進型。由于它采集粒譜廣 、效率高、生物失活率低等原因而廣泛使用至今�？諝馕⑸�物采樣器一般分為七大類：液體 式、固體式、沉降式、離心式、光散射式和大容量式。本文將對離心式空氣微生物采樣器(R CS)作詳細討論�？諝馕⑸�物測試標準見表3。

表3　國內(nèi)外有關(guān)空氣微生物的測定標準(CFU/m³)

　　 3.3　表面微生物　為了檢測潔凈室中墻壁、地板、儀器表面、桌 面、門把等帶菌情況，通常選用接觸壓印法(Cortact)和棉拭法(Swabbing)等方法。需要時 ，還可與過濾裝置相結(jié)合來完成棉拭采樣。1941年，Walter和Hvcker報道了COntact瓊脂平 板方法，以后，Angelotti和Fotert等作了進一步的工作。帶菌狀況都有要求，歐共體GMP( 最新草案)規(guī)定，100級：平均菌落數(shù)不可超過5 個；1000級：25個；100000級：50個。表面微生物的檢測，越來越受到人們的重視。

　　3.4　關(guān)于沉降平皿(Settle plate)　1881年Kock創(chuàng)立。依靠空氣中的粒子自然沉降于瓊脂平板上的這種采集方法，由于粒子沉降 的速率很慢，如需采集到有效數(shù)量的粒子，就需暴露很長時間。但因空氣中的致病菌數(shù)量是 很少的，金黃色菌菌球菌在醫(yī)院病房空氣中平均每140升才有一個活菌粒子，為了彌補這個 缺陷，曾采用直徑為14公分的大平皿，以增加瓊脂的暴露面積。Harding和Williams還曾用 一種多層平板的方法來進一步暴露面積，每層放一個14公分直徑的平板，但結(jié)果不堪滿意。

　　奧姆梁斯基曾試圖把采樣后平板上長出的菌落換算成一定體積空氣中的微生物含量，以便能 利用沉降平板法的采樣結(jié)果來測定空氣中的活菌濃度。為此，他設(shè)定了在100cm²營養(yǎng)瓊脂 上暴露5分鐘后，培養(yǎng)長出的菌落，即相當于10升空氣中的活菌數(shù)。由于懸浮在空氣中的含 菌粒子直徑不超過100μm，這些小粒子在空氣中的沉降受空氣阻力的影響，其沉降速率遵循 國際上的Stokes公式。根據(jù)這個公式，粒子的沉降速率與其大小成正比，但是，奧姆梁斯基 恰好忽略了這一點，因此，它是不能成立的。例如，直徑1μm的含菌粒子，在5分鐘內(nèi)沉降 距離為1.05cm，大部分的粒子就沉降不到瓊脂表面上。

　　由于潔凈室已濾除了大部分大顆粒，一般用此法是無意義的。但是，人為、環(huán)境和潔凈裝置 故障等原因引起的較大顆粒污染以及沉降平板采樣潔的簡便，可作為日常監(jiān)測潔凈室水平的 一種參考方法。

　　3.5　關(guān)于RCS^［9］　離心式空氣采樣器(The Reuter Centrifugal Sampler,RCS)被介紹作為一種在醫(yī)院使用的檢 測空氣微生物的儀器，由于它輕便，無噪音而廣泛使用，并擴展到制藥工業(yè)等領(lǐng)域。RCS通 過離心收集顆粒，為制藥工業(yè)所接受，因為它似乎符合FDA所描述的“Active”采樣儀器。 。Gre-schel等認為它相當有效，Macher等則持反對意見。多年來，許多研究者研究了帶菌 顆粒的大小，結(jié)論是：5-15μm，中等粒是13μm，而4μm以下很少。這些結(jié)果是從醫(yī)院、手 術(shù)室、辦公室、實驗室和制藥無菌室所獲得。他們認為，如果顆粒大小是已知的，RCS可定 量測定細菌濃度，但是，目前這些顆粒大小是未知的，故不能把它視為定量采樣器，只能歸 于沉降平皿一樣的類型。Delmore等發(fā)現(xiàn)，100級無菌室中，RCS/slit比率是2.1，即RCS是s lit采樣器微生物捕促率的210%有效。我國丁璽華等也仿制了RCS，選用國產(chǎn)元件，試制了LW C-1型離心式空氣采樣器。

雖然RCS有正反兩方面的爭議，但由于它有許多優(yōu)點，并明顯優(yōu)于沉降平皿，1986年，西方 近一半的制藥公司采用了RCS，作為空氣微生物采樣器，我國正在逐漸推廣。