高效液相色譜柱的分類與應(yīng)用特點(diǎn)

高效液相色譜柱大致可分為五類:

一、高效反相液相色譜柱

     以C18為代表的高效反相液相色譜柱一直被描述為藥物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、方法驗(yàn)證(validation)的心臟! 高效反相液相色譜柱也極其廣泛應(yīng)用在藥物代謝及動(dòng)力學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)療健康、生物分析檢測(cè)、毒品和興奮劑檢測(cè)、食品安全分析、環(huán)境分析、軍事、國(guó)土安全等領(lǐng)域! 高效反相液相色譜制備柱也是最重要的分離純化技術(shù)之一!

  無論是過去，現(xiàn)在和可預(yù)見的未來, 以球形B型硅膠(5um 或 3um)為材料骨架的高效反相液相色譜柱在實(shí)際應(yīng)用中永遠(yuǎn)占有統(tǒng)治地位!常規(guī)HPLC方法的開發(fā)幾乎總是從C18作為出發(fā)點(diǎn)，反相色譜占了80%以上的應(yīng)用。

     過去數(shù)十年來, 無數(shù)努力集注于:

  1) 改善硅膠的品質(zhì), 優(yōu)化鍵合化學(xué); 2)開發(fā)新穎的材料骨架替代硅膠。

十多年前, 使用有機(jī)硅材料取代無機(jī)硅材料作為起始原料生產(chǎn)球形硅膠代表一個(gè)劃時(shí)代的革命! 生產(chǎn)的球形硅膠命名為B型球形硅膠。無機(jī)A型硅膠重金屬含量很高, 硅膠表面若干位置嚴(yán)重酸化及螯合效應(yīng)等導(dǎo)致許多堿性化合物回收率低。球形B型硅膠重金屬含量很低, 在非常大的程度上消除了A型無機(jī)硅膠表面若干位置嚴(yán)重酸化及螯合效應(yīng)等問題。用B型球形硅膠合成高效液相色譜填料, 導(dǎo)致高效液相色譜柱產(chǎn)品質(zhì)量有質(zhì)的飛躍!

然而，另一方面，基于客戶的大量反饋和我們對(duì)幾乎所有色譜廠商產(chǎn)品的評(píng)估, 我們相信鍵合化學(xué)問題沒有獲得很好的解決。具體體現(xiàn)在:
(1) “純粹”反相機(jī)理的鍵合相例如C18和C8市場(chǎng)上仍然是單功能，三功能和聚合物鍵合相"魚目混雜"。   

(2) 鍵合相封端問題沒有獲得很好的解決, 一直是困擾色譜領(lǐng)域最大的問題! 迄今為止全部的嘗試只獲得有限的成功。
(3) 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相是C18高效反相液相色譜"衛(wèi)星群"中最重要的產(chǎn)品, 是C18和C8鍵合相最重要的補(bǔ)充。
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的鍵合方法是用aminopropyl鍵合相和長(zhǎng)鏈羧酸縮合反應(yīng)形成一個(gè)C16酰胺。

   那么市場(chǎng)上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群的主要問題是什么? 極性嵌入式鍵合相和所謂的水相C18主要問題是鍵合相泄漏, 鍵合相不穩(wěn)定等。兩者之間的內(nèi)在差異是: 極性嵌入式鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩(wěn)定等問題能夠獲得很好的解決, 但使用極性硅烷試劑封端的所謂的水相C18鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩(wěn)定等問題是不可逆轉(zhuǎn)的。

    在類似C18鏈長(zhǎng)度的硅烷試劑中嵌入極性酰胺或酰酯, 使得鍵合相親水, 在100%水相條件下穩(wěn)定。但按照類似C18的鍵合化學(xué), 鍵合覆蓋率低, 鍵合相不穩(wěn)定。

     Chrom-Matrix InnovationTM PEG鍵合相是非常極性的產(chǎn)品, 但測(cè)試結(jié)果表明: PEG鍵合相非常穩(wěn)定, 在LC-MS測(cè)試中沒有檢測(cè)到泄漏。這一成功和我們?cè)谀z體與界面科學(xué)領(lǐng)域的長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)幫助我們成功開發(fā)了新型催化條件下新的鍵合化學(xué)。加上超臨界流體技術(shù)封端, Chrom-Matrix InnovationTM 極性酰胺或酰酯鍵合相比那么市場(chǎng)上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群穩(wěn)定得多。色譜柱產(chǎn)品質(zhì)量和壽命有質(zhì)的飛躍!  即使這樣, LC-MS測(cè)試顯示: Chrom-Matrix InnovationTM 極性酰胺或酰酯鍵合相仍然有非常低的泄漏。

(4) 無泄漏低孔和高比表面積C18鍵合相等是小分子化合物分離純化的終端保證!

制備型高效反相液相色譜柱, 制備型高效正相液相色譜柱, 制備型高效離子交換色譜柱和對(duì)應(yīng)的閃光色譜(flash chromatograpy) 是小分子化合物分離純化最重要的終端保證!

但是市場(chǎng)上大多數(shù)色譜產(chǎn)品和閃光色譜(flash chromatograpy)鍵合相有明顯的泄漏。盡管泄漏在紫外可見檢測(cè)器中是看不見的, LC-MS信號(hào)非常明顯! 最重要的是泄漏的硅烷實(shí)實(shí)在在洗脫到顧客的終端純化產(chǎn)品中, 而且沒有考慮在內(nèi)。

Chrom-Matrix公司成功地解決了上述所有問題! Innovation^TM所有反相高效液相色譜產(chǎn)品都使用B型球形硅膠合成, 使用最優(yōu)化個(gè)性化合成工藝, 使用超臨界流體封端, 使用LC-MS/MS和表面電荷滴定等多種獨(dú)特技術(shù)配合多種色譜測(cè)試保證產(chǎn)品的品質(zhì)和批次重現(xiàn)性。其中大部分產(chǎn)品LC-MS/MS測(cè)試無泄漏, 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相非常低的泄漏。

二、高效正相液相色譜柱

    正相液相色譜是最早的色譜模式。直到現(xiàn)在, 合成后通過硅膠柱做進(jìn)一步純化仍然是有機(jī)化學(xué)家日常工作的一個(gè)重要組成部分。在理論上, 幾乎所有的溶于正己烷，乙酸乙酯或異丙醇的有機(jī)化合物都可以用高效正相液相色譜分析。但在實(shí)際應(yīng)用中，高效正相液相色譜的應(yīng)用比高效反相色譜少得多。這是因?yàn)檎�己�? 乙酸乙酯沒有像水，甲醇或乙腈那樣受歡迎。此外, A型硅膠正相液相色譜給客戶一個(gè)慣性思維: 高效正相液相色譜的平衡時(shí)間很長(zhǎng)。

事實(shí)上, 高效正相液相色譜在制備規(guī)模的色譜純化中一直發(fā)揮了重要作用。這是因?yàn)?

(1) 高效正相液相色譜比高效反相色譜柱壓低得多。

(2) 高效正相液相色譜用的溶劑例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去。

(3) 吡咯等蒸發(fā)性溶劑徹底改善了堿性有機(jī)化合物在B型球形硅膠, Diol和PEG正相液相色譜柱上的峰形。

此外, 不管制備規(guī)�；蚍治鰷y(cè)試,

(1) 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離分析必須使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。

(2) 環(huán)境中腐殖酸的結(jié)構(gòu)鑒定必須使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然后使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。這種小分子聚集的自然現(xiàn)象一定相當(dāng)廣泛。

PEG正相液相色譜鍵合相等將讓客戶重新評(píng)估高效正相液相色譜的價(jià)值。

三、高效親水液相色譜柱 

高效親水液相色譜是一個(gè)介于正相和反相高效液相色譜之間的運(yùn)作模式。這個(gè)模式最早來自NH2色譜柱的糖分析應(yīng)用。在此之后，逐步在Diol, 硅膠和親水性高分子鍵合相找到了一些有價(jià)值的應(yīng)用。

近年來，高效親水液相色譜成為比較流行的色譜的運(yùn)作模式, 主要是因?yàn)橛H水性化合物有良好的保留和高效親水液相色譜在LC-MS/MS中的應(yīng)用。

盡管如此，迄今為止沒有權(quán)威的論文, 評(píng)論和教科書揭示了高效親水液相色譜真正的價(jià)值和局限性。

近年來，我們幫助客戶采用高效親水液相色譜的運(yùn)作模式成功地開發(fā)和驗(yàn)證了數(shù)以百計(jì)的HPLC和LC-MS/MS應(yīng)用。我們總結(jié)出:

(1) 高效親水液相色譜是LC-MS/MS應(yīng)用的第一選擇。請(qǐng)參閱我們的LC-MS/MS產(chǎn)品手冊(cè)應(yīng)用案例。

(2) 除了Innovation^TM TX多功能色譜柱, 所有親水液相色譜僅可用于分析，而不是制備規(guī)模的分離。

(3) 高效親水液相色譜流動(dòng)相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他調(diào)節(jié)), 流動(dòng)相B是水(pH值用少量的甲酸或其他調(diào)節(jié))�；�合物洗脫秩序類似于正相液相色譜, 疏水性化合物首先洗脫, 然后是親水化合物。流動(dòng)相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有機(jī)溶劑。

(4) 進(jìn)樣體積太大會(huì)導(dǎo)致一些峰值扭曲或分裂。柱承載能力通常是非常小的。

(5) Innovation^TM TX, HP Amide, Silica三種高效親水液相色譜覆蓋99 ％以上的應(yīng)用, NH2色譜柱用于簡(jiǎn)單糖分析應(yīng)用。

(6) 除了Innovation^TM TX多功能色譜柱, 所有親水高效液相色譜柱柱效不如正相和反相高效液相色譜。

四、高效強(qiáng)陽離子交換液相色譜柱

    離子交換液相色譜是生物分離最常見最有用的一種色譜模式。另一方面，小分子分離分析極少使用高效離子交換液相色譜。這是因?yàn)?

(1) 新穎的反相和多功能鍵合相例如Innovation^TM Polar-Embedded Stable Amide和TX連續(xù)出現(xiàn), 在很大的程度上補(bǔ)償了常規(guī)C18鍵合相的缺點(diǎn)。 C18, C8鍵合相也有重大進(jìn)展。高效親水液相色譜柱也覆蓋了許多分析應(yīng)用。

(2) 相比之下, 硅膠基質(zhì)的高效離子交換鍵合相近幾十年來產(chǎn)品質(zhì)量沒有取得質(zhì)的突破。硅膠基質(zhì)的高效離子交換鍵合相柱壽命普遍短, 疏水相互作用明顯。

(3) 聚合物基質(zhì)的高效離子交換鍵合相在生物分析上面的應(yīng)用比較廣泛, 但其柱效過低，表面積太小，對(duì)小分子分離分析難有吸引力。

    科學(xué)發(fā)明往往來自現(xiàn)實(shí)世界的挑戰(zhàn)! 在對(duì)海洋毒素, 微生物代謝產(chǎn)物和天然植物(包括中草藥)有效成分的分離純化過程中, 我們深深感到高質(zhì)量的硅膠基質(zhì)的高效離子交換鍵合相是必不可少的! 因此，我們開發(fā)了硅膠基質(zhì)的SCX, WCX, DEAE和SAX高效離子交換鍵合相。

五、InnovationTM高效多功能液相色譜柱

我們介紹四種高效多功能液相色譜柱:

(1) Innovation^TMTX毒品分析HPLC柱

    Innovation^TM TX毒品分析HPLC柱是實(shí)際應(yīng)用中最有價(jià)值的一種色譜柱。由于其在毒品分析上出色的表現(xiàn), DEA專家稱它毒品分析HPLC柱。Innovation^TM TX是一個(gè)多功能色譜柱, 具有反相, 弱陽離子離子交換, 親水等作用, 能夠使用在100%水相或100%有機(jī)相。由于它的弱陽離子離子交換機(jī)理,  Innovation^TM TX對(duì)堿性化合物的分離效果是所有色譜柱中最好的。它對(duì)堿性化合物有完美的峰形。

它的絕對(duì)柱效和反相色譜分析柱相同的，甚至優(yōu)于反相, 遠(yuǎn)勝傳統(tǒng)的親水色譜分析柱。

(2) Innovation^TM DNPH HPLC柱

    Innovation^TM DNPH HPLC柱主要用于環(huán)境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析應(yīng)用中, 任何其他色譜柱沒有它優(yōu)越的選擇性。

(3) Innovation^TM PAH HPLC柱

(4) 血漿，血清直接進(jìn)樣的Innovation^TM PEG色譜柱

    限制進(jìn)入鍵合相(Restricted access media)最早由Merck公司發(fā)明。一個(gè)典型的方法是首先制造Diol鍵合相, 然后通過酰酯或酰胺反應(yīng)嵌入疏水鏈。硅膠外表面的酰酯或酰胺鏈?zhǔn)褂妹盖袛嚅_。但酶不能擴(kuò)散到內(nèi)表面。由此外表面親水, 內(nèi)表面疏水。血漿，血清, 尿樣可以直接進(jìn)樣。蛋白質(zhì)等生物流體通過親水外表面時(shí)沒有保留, 小分子化合物可以擴(kuò)散到內(nèi)表面通過反相保留最后洗脫。限制進(jìn)入鍵合相(Restricted access media)在學(xué)術(shù)領(lǐng)域比較歡迎, 但隨著固相萃取產(chǎn)品的發(fā)展, 在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用相當(dāng)少。

    但我們最后發(fā)現(xiàn), 血漿，血清, 尿樣可以直接進(jìn)樣的限制進(jìn)入鍵合(Restricted access media), 尤其是Innovation^TM PEG色譜柱在藥物代謝領(lǐng)域具有獨(dú)特價(jià)值。藥物代謝研究, 尤其是全盲條件下的早期藥物代謝研究, 追求絕對(duì)回收率! 一種藥物代謝之后, 打破成許多小分子化合物。全盲條件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代謝產(chǎn)物。最理想的方法是, 血漿，血清, 尿樣可以直接進(jìn)樣, 每毫升收集液使用14C同位素檢測(cè), 然后建立一個(gè)明確的代謝概況。

    Innovation^TM PEG色譜柱是一種多功能色譜柱。它是最好的正相色譜柱! 同時(shí)，使用乙醇取代儲(chǔ)存溶劑后, 它能夠被用來作為反相讓血漿，血清, 尿樣可以直接進(jìn)樣。