PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）


【原理】
PCR（polymerase chain reaction）用于在體外將微量的目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增，以便進(jìn)行分析。反應(yīng)體系：①樣品DNA；②引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個(gè)核苷酸），用于擴(kuò)增夾在雙引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)之間的區(qū)域；③4種dNTP；④Tag DNA聚合酶，是從一種嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）中分離出來的。此酶最適作用溫度為75～80℃，但短時(shí)間在95℃下不失活。⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反應(yīng)過程：①變性：將反應(yīng)液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95℃）使DNA雙鏈解離；②復(fù)性：降溫（約60℃左右）退火，使引物與模板結(jié)合；③延伸：升溫度至70-75℃，在引物的引導(dǎo)下合成模板單鏈的互補(bǔ)鏈，從而形成DNA雙鏈片段；④重復(fù)上述“變性——復(fù)性——延伸”的過程。最初幾次循環(huán)中形成的長鏈DNA較多，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，長鏈DNA以算術(shù)級數(shù)增加，而夾在兩個(gè)引物之間的目標(biāo)DNA以指數(shù)級數(shù)增長，經(jīng)大約20—30次循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物中主要是目標(biāo)DNA。

【材料】
1. 試劑和溶液 
（1）10 × PCR緩沖液
500 mM 氯化鉀
100 mM Tris-Cl (室溫時(shí)pH 8.3)
15 mM 氯化鎂
（2）10 mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液－含有所有四種dNTPs(pH 8.0)
（3）耐熱的DNA 聚合酶：
① Taq DNA 聚合酶是從表達(dá)克隆嗜熱水生菌的DNA 聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量約為94 千道爾頓的多肽組成。Taq DNA聚合酶對熱穩(wěn)定，能在較高的溫度下利用引物將單鏈模板合成為DNA。 催化一典型的PCR所需酶量約為2單位。加酶量過多則有可能導(dǎo)致非靶序列的擴(kuò)增。
Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR過程中核苷酸摻入錯誤率可達(dá)每循環(huán)2 × 10-4個(gè)核苷酸，約比使用大腸桿菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段時(shí)高4倍。對于一個(gè)30輪循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)來說，這一摻入錯誤率將導(dǎo)致0.25％的總錯誤頻率。這一頻率似隨和濃度的升高而增大。這些錯誤的摻入可以發(fā)生在擴(kuò)增產(chǎn)物的任何位置，既有顛換也有轉(zhuǎn)換（但并無長的缺失、嵌合或插入）。
單位的定義：一單位是指于74ºC將l0 nmol的脫氧核糖核苷酸30分鐘內(nèi)摻入到酸性沉淀的物質(zhì)中。其實(shí)驗(yàn)條件是：25 mM TAPS (pH9.3), 50 mM 氯化鉀, 2 mM 氯化鎂, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鮭魚精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP。
② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的雙重活性。當(dāng)按推薦量使用時(shí)，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產(chǎn)量。
常規(guī)PCR擴(kuò)增靶DNA序列一般在5 kb以內(nèi)。而rTth DNA 聚合酶可從人類基因組DNA中擴(kuò)增至19.6 kb的β－球蛋白基因群和噬菌體λDNA的42 kb的片段。 
（4）瓊脂糖凝膠
（5）10 µM的上游和下游引物
（6）DNA模板
（7）對照DNA（含有靶序列的DNA）
（8）DNA長度標(biāo)準(zhǔn)參照物
2. 設(shè)備
（1）0.2 ml PCR擴(kuò)增管
（2）可預(yù)先設(shè)定擴(kuò)增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)

【方法】

方法一、基本的PCR方法
下面介紹的基本PCR方法可作為任何PCR擴(kuò)增的一般指導(dǎo)和出發(fā)點(diǎn)。由于各種PCR反應(yīng)條件（如PCR擴(kuò)增次數(shù)、溫度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物、氯化鎂以及模板DNA）變異極大，應(yīng)根據(jù)具體情況，對各種PCR反應(yīng)條件進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。
1．按以下次序，將各成分加入0.2 ml滅菌擴(kuò)增管中：
成分                     體積                 終濃度
10 × PCR緩沖液                5 µl                    1 ×
10 mM dNTP溶液(pH 8.0)         1 µl             每種0.2 mM
10 µM 上游引物                 2.5 µl                0.5 µM
10 µM 下游引物                 2.5 µl                0.5 µM
5單位/µl 耐熱DNA聚合酶        0.5 µl              2.5單位
DNA模板                       1-10 µl             1 pg-1µg
消毒的蒸餾水                  至50 µl   
* 我們主張，對于多管反應(yīng)可配制混合液于一管中，然后分裝至各管，以減少試劑損失和各管分別加樣的不準(zhǔn)確性。
2．將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。
3．蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。
4．小管在溫度循環(huán)器（PCR儀）中94ºC溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。
5. 按以下方法進(jìn)行25-35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增：
變性        94ºC          30秒 
退火        55ºC          30秒
延伸        72ºC       1分鐘/1 kb
6．72ºC溫育PCR樣本10分鐘，可于4ºC維持。樣本可貯存于-20ºC直至使用。
7．采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標(biāo)準(zhǔn)的DNA作參照。
方法二、熱啟動方法
熱啟動PCR的方法是在反應(yīng)溫度降至80ºC時(shí)添加Taq DNA聚合酶，以保證高特異性PCR產(chǎn)物的合成。
1．如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反應(yīng)的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。
2．將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋之。
3．蓋緊小管，短暫離心，以便于PCR混合物沉于管底。
4．小管在PCR儀中94ºC溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。
5. 94ºC溫育后，維持PCR反應(yīng)在80ºC。
6．每一PCR反應(yīng)管添加0.5 µl (2.5 U)的 Taq DNA 聚合酶，注意應(yīng)保證酶加入到油下面的PCR混合物中。
7．按照基本的PCR方法所述，繼續(xù)完成25-35個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸。

【注意事項(xiàng)】
1. PCR引物設(shè)計(jì)：
引物設(shè)計(jì)可能是PCR擴(kuò)增成功最關(guān)鍵的因素。如引物設(shè)計(jì)欠佳，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，甚至擴(kuò)增失敗，其原因是設(shè)計(jì)欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競爭性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。
在引物設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素，其中最重要的是引物長度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補(bǔ)問題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。 
（1）引物長度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時(shí)間均至少部分與PCR引物長度相關(guān)聯(lián)，因此引物長度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
（2）溶解溫度(Tm)：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計(jì)算：Tm＝2(A+T) + 4(G+C)。
需注意PCR反應(yīng)至少有兩個(gè)（一對）引物，兩個(gè)寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時(shí)可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。
（3）引物序列互補(bǔ)：設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)絕對沒有3個(gè)堿基以上的內(nèi)引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時(shí)。
（4）G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45％-55％。在選擇的引物序列中應(yīng)沒有多G 或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A 和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物－模板復(fù)合物展開延伸，降低擴(kuò)增的效率。同時(shí)多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應(yīng)被避免。 
（5）3’-末端序列：為控制引物錯配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3’末端的位置。
總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)應(yīng)認(rèn)真小心。對于一個(gè)成功的PCR來說，幾個(gè)重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50％、長度約為20個(gè)堿基，因此能使Tm值處于56-62ºC范圍。分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設(shè)計(jì)，節(jié)省時(shí)間，減少錯誤，可應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計(jì)、選擇、確定寡核苷酸引物。
最常用的引物設(shè)計(jì)軟件和網(wǎng)站是：http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/ primer3_www.cgi
2. 模板DNA：
溶解模板DNA于含有低濃度的EDTA（<0.1 mM）的10mM Tris-Cl（pH 7.6）中。DNA的濃度分別為：哺乳動物基因組（100 µg/ml），酵母基因組DNA（1 µg/ml），細(xì)菌基因組DNA（0.1 µg/ml），質(zhì)粒DNA（1-5 µg/ml）。
3. 防止污染：由于PCR能夠使單個(gè)DNA分子得以擴(kuò)增，所以應(yīng)當(dāng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染，尤其是在待擴(kuò)增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。
（1）如有可能，應(yīng)在裝有紫外燈的層流式工作臺內(nèi)吸加PCR試劑和進(jìn)行反應(yīng)。凡不用工作臺時(shí)應(yīng)打開紫外燈。應(yīng)使工作臺內(nèi)始終置有PCR專用的微量離心機(jī)、一次性手套、整套移液器和其他必需品。由于自動移液器的管部是常見的污染源，因此配液和移液時(shí)應(yīng)當(dāng)使用配有一次性吸頭和活塞的正向排液式移液器。準(zhǔn)備一套特殊的試劑和溶液專用于PCR。所有的玻璃器皿于150ºC下烘烤6小時(shí)，所有塑料器皿、緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經(jīng)過高壓處理。
（2）一旦進(jìn)入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。
（3）準(zhǔn)備專供自己使用的成套試劑，分裝為小份，而且最好在靠近工作臺的冰箱中設(shè)立專門位置來保存。這些試劑不得用于其他用途。配制這些試劑時(shí)，要用從未接觸過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所用任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后便將這一小份全部廢棄，不得重新置存。
（4）裝有PCR試劑的微量離心管打開之前，應(yīng)先在專用工作臺內(nèi)的微量離心機(jī)上作瞬時(shí)離心（10秒）。這樣可使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會。
（5）最好在加完所有的其他反應(yīng)成份、包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加模板DNA。將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕彈擊管側(cè)壁，以混勻液體。再作瞬時(shí)離心（10秒），使水相和有機(jī)相分開。
（6）將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時(shí)，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應(yīng)。所有并非即用管均應(yīng)蓋嚴(yán)。拿過模板DNA管后應(yīng)更換手套。    
（7）每一次PCR必須包含陽性和陰性對照。陽性對照用于監(jiān)測PCR反應(yīng)的效率，而陰性對照用于確定是否存在DNA靶序列的污染。
（8）只要有可能，就應(yīng)當(dāng)設(shè)置陽性對照反應(yīng)（即由少量適當(dāng)?shù)陌行蛄袇⑴c的PCR）。對靶序列DNA所作的適當(dāng)稀釋工作應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)別的位置進(jìn)行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實(shí)驗(yàn)室專門進(jìn)行PCR的位置。
（9）必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA，但含有PCR系統(tǒng)中所有的其他成份的對照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好其他所有PCR以后才進(jìn)行吸加。
4．我們上面介紹的只是一種基本的PCR反應(yīng)條件，對于具體的每一種PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件差異很大，需要根據(jù)情況調(diào)整。
（1）時(shí)間：上面介紹的時(shí)間適用于在0.2 ml薄壁管進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體積為50 µl，熱循環(huán)儀為Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR儀（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的設(shè)備和反應(yīng)體積發(fā)生改變，則時(shí)間和溫度均需要調(diào)整。
每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合物達(dá)到所需要的溫度后開始計(jì)算。一般來說，由混合液原溫度達(dá)到所要求溫度的時(shí)間需要30-60秒。溫度滯后時(shí)間的長短取決于以下幾個(gè)因素，包括反應(yīng)管的類型、反應(yīng)混合物的體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩個(gè)連續(xù)步驟間的溫度差。因此調(diào)節(jié)溫育時(shí)間以補(bǔ)償這一滯后時(shí)間是非常重要的。
兩寡核苷酸引物之間的距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時(shí)間也越長。上面給出的反應(yīng)時(shí)間是按1000個(gè)核苷酸的靶序列擬定的。
（2）溫度：選擇寡核苷酸引物到DNA模板的退火溫度是一個(gè)折衷的方案。如果降低退火溫度則擴(kuò)增效率提高，但引物與模板間的錯配現(xiàn)象又可明顯增加。若將溫度提高，則擴(kuò)增反應(yīng)的特異性增加，但總的反應(yīng)效率則會下降。因此理想的辦法是設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定擴(kuò)增反應(yīng)的最適退火溫度。
（3）循環(huán)次數(shù)：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)混合液中靶DNA的濃度，若將哺乳動物基因組中單拷貝基因擴(kuò)增至能為瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳所見，至少需要25個(gè)循環(huán)。
靶序列的指數(shù)式的擴(kuò)增不是一個(gè)無限制的過程。在正常反應(yīng)條件下，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（即擴(kuò)增約106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成為制約反應(yīng)進(jìn)行的因素。如需進(jìn)一步擴(kuò)增，應(yīng)將所得的DNA樣品稀釋1000至10000倍后，再作為模板進(jìn)行新的PCR。
（4）緩沖液：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液于72ºC溫育時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)多單位，致使緩沖液的pH值接近7.2。二價(jià)陽離子的存在至關(guān)緊要，鎂離子優(yōu)于錳離子，而鈣離子則無效。鎂離子的最佳作用濃度相當(dāng)?shù)?1.5 mM)，因此重要的是，所制備的模板DNA中不應(yīng)含有高濃度的螯合劑，如EDTA；也不應(yīng)含有高濃度的帶負(fù)電荷離子基團(tuán)，如磷酸根。所以，用作模板的DNA應(yīng)溶于10 mM Tris-Cl (pH 7.6), 0.1 mM EDTA (pH 8.0)中。
在較為廣泛的范圍內(nèi)，這種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對于各種模板的寡核苷酸引物都能行之有效，當(dāng)它并非對于模板與引物的任何一種特定組合都是最佳的。因此，應(yīng)當(dāng)將以上所列條件作為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行修飾和改良。每當(dāng)首次使用靶序列和引物的一種新組合時(shí)，或者，dNTPs或引物的濃度變化時(shí)，特別要將Mg2+濃度調(diào)至最佳。dNTPs是反應(yīng)中磷酸根的主要來源，其濃度的任何變化都將影響到Mg2+的有效濃度。我們建議設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)的Tris-Cl (10 mM)和氯化鉀 (50 mM)濃度相同，而氯化鎂濃度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來比較各擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
PCR可在熱循環(huán)儀（即PCR儀）中自動進(jìn)行，以使反應(yīng)各循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)化。
5. 一般來說，如第一次用新的模板DNA、新的引物或者新制備的耐熱DNA聚合酶作PCR，擴(kuò)增將不如預(yù)期理想。PCR反應(yīng)條件需仔細(xì)調(diào)整，以抑制非特異擴(kuò)增和（或）提高目標(biāo)DNA的產(chǎn)量。
6. 一個(gè)成功的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可出現(xiàn)一個(gè)顯而易見的與預(yù)期大小一樣長度的DNA片段，此可通過DNA序列分析、Southern 雜交和或限制性圖譜分析確定。