檢測(cè)自身免疫抗體的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)簡(jiǎn)介

相對(duì)熒光是芯片技術(shù)中常用的輸出信號(hào)。可以使用熒光內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)（獨(dú)立小球裝置或芯片位點(diǎn)）對(duì)所有測(cè)定信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這種標(biāo)準(zhǔn)化彌補(bǔ)了照明和檢測(cè)系統(tǒng)的波動(dòng)。還可以根據(jù)相應(yīng)的臨床標(biāo)本類型及和加樣容積設(shè)計(jì)自身免疫測(cè)定中的其他內(nèi)部檢測(cè)。這些內(nèi)部對(duì)照是每個(gè)多路測(cè)定試驗(yàn)必須具有的功能。

多路復(fù)用檢測(cè)中還可以考慮使用對(duì)一種分析物或一類分析物具有特異性的其他內(nèi)部對(duì)照。例如，通過(guò)類風(fēng)濕因子(RF)內(nèi)部測(cè)定可以檢測(cè)RF對(duì)IgM自身抗體分析的潛在干擾。檢測(cè)總IgG將有助于確保IgG高丙種球蛋白標(biāo)本不會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)性抑制而干擾IgM分析。

正確使用內(nèi)部對(duì)照需要掌握分析物的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題、進(jìn)行測(cè)定的基質(zhì)以及所用設(shè)備的性能特點(diǎn)。內(nèi)部對(duì)照的使用可以提高測(cè)定的精度和準(zhǔn)確性，并且可以排除未知的矛盾結(jié)果。

 

多路復(fù)用自身免疫測(cè)定法的普遍認(rèn)存在一些技術(shù)障礙。與核酸芯片相比，蛋白質(zhì)芯片的開發(fā)難度更大。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在分子大小、電荷、外形、疏水性、基因轉(zhuǎn)譯后形成的類型和程度、以及四級(jí)結(jié)構(gòu)方面具有很大區(qū)別。而且一些蛋白質(zhì)連接在固相載體上后難以保持特異性和活性。

 

對(duì)自身抗原進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，正如使用各種免疫分析方法一樣，需要合理設(shè)定的、可重復(fù)性、可調(diào)定量抗原。利用芯片技術(shù)進(jìn)行自身抗原測(cè)定存在一些問(wèn)題，包括如何獲得芯片構(gòu)建所需的功能蛋白表達(dá)、開發(fā)將蛋白質(zhì)連接到載體表面并保持其活性的技術(shù)以及通過(guò)化學(xué)和檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)獲得較高的分析靈敏度和較大的動(dòng)態(tài)范圍。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)解釋及儲(chǔ)存也是需要考慮的問(wèn)題。而且對(duì)每種分析物都需要進(jìn)行性能驗(yàn)證。此外，由于經(jīng)常存在基因轉(zhuǎn)譯后形成的各種變體，蛋白質(zhì)化學(xué)非常復(fù)雜。

 

重復(fù)性：多路復(fù)用分析技術(shù)可以影響分析結(jié)果的重復(fù)性。通過(guò)對(duì)所有試劑和反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行廣泛優(yōu)化以及重復(fù)檢測(cè)可以達(dá)到較高的精度。使用平板芯片時(shí)，可能要對(duì)每種分析物的兩個(gè)或多個(gè)復(fù)本盡心檢測(cè)，然后對(duì)變異可接受性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，并計(jì)算出平均值。使用球形懸浮芯片時(shí)，通常要對(duì)每種分析物的數(shù)百個(gè)小球或化驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。一般來(lái)說(shuō)，小球的數(shù)量與化驗(yàn)精度存在直接聯(lián)系。

干擾性：芯片位點(diǎn)之間的相互干擾是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。使用平板芯片時(shí)會(huì)出現(xiàn)這種信號(hào)干擾，但理論上，這種干擾對(duì)微球芯片的影響更大。在微球懸浮芯片中，測(cè)定反應(yīng)中心并未分割成獨(dú)立的空間位點(diǎn)；各個(gè)小球裝置在使用前有可能在液相中發(fā)生長(zhǎng)時(shí)間的相互作用。

 

與微球反應(yīng)的蛋白質(zhì)主要通過(guò)共價(jià)鍵連接，但是，即使徹底清洗后通常還會(huì)有一些疏松連接的蛋白質(zhì)。與小球裝置非共價(jià)連接的蛋白質(zhì)會(huì)從固相表面緩慢解離，并抑制液相反應(yīng)物的正常反應(yīng)；結(jié)果就可能出現(xiàn)假陰性。解離的蛋白質(zhì)也可能遷移并依附到另一小球裝置的表面，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

應(yīng)進(jìn)行全面的穩(wěn)定性試驗(yàn)，以確保結(jié)合了配合基的蛋白質(zhì)在產(chǎn)品保存期內(nèi)都可與固相基質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合。在多路分析驗(yàn)證階段，必須確保多路復(fù)用分析的結(jié)果與相應(yīng)的單路分析結(jié)果相當(dāng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)最好在標(biāo)稱的保存期末進(jìn)行，這時(shí)最容易發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。只有所有分析物的多路和單路分析結(jié)果都近乎相同時(shí)，研究人員才能認(rèn)定小球裝置的混合并未產(chǎn)生相互干擾(圖3)。

 

多路復(fù)用測(cè)定中潛在的相互作用數(shù)是微球芯片中測(cè)定次數(shù)的一個(gè)函數(shù)（表III）。隨著芯片復(fù)雜程度的增加，各分析之間可能發(fā)生的不良作用也快速增加。生產(chǎn)前必須解決這一干擾問(wèn)題。

 

可對(duì)自身抗體及其他分析物進(jìn)行多路復(fù)用測(cè)定的全自動(dòng)系統(tǒng)現(xiàn)已上市。該系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)控制免疫測(cè)定開放系統(tǒng)分析儀能夠連續(xù)、隨機(jī)地調(diào)用標(biāo)本和試劑，并且與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)、原管采樣及STAT功能完全整合。這種尖端產(chǎn)品在技術(shù)、成本和工作流程方面具有極大優(yōu)勢(shì)，因此采用這種新技術(shù)的設(shè)備將為您提供一種傳統(tǒng)ELISA、免疫印跡及IFA技術(shù)之外的誘人選擇。