激光共聚焦技術(shù)與非損傷微測技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢

2008年諾貝爾化學(xué)獎授予三位發(fā)現(xiàn)熒光蛋白的科學(xué)家，表彰他們對生命科學(xué)發(fā)展的重要貢獻(xiàn)。熒光技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中非常重要的技術(shù)，也是目前檢測生物體樣品內(nèi)離子分子狀態(tài)的最佳手段。激光共聚焦技術(shù)的出現(xiàn)，使熒光技術(shù)如虎添翼。通過共聚焦顯微鏡和飛秒紅外激光器等部件的配合使用，不僅可以得到非常清晰的熒光圖像，進(jìn)行多重?zé)晒鈽?biāo)記的定位和定量分析，還具有圖像三維重建、熒光共振能量轉(zhuǎn)移譜測定甚至膜電位測定等功能，成為生命科學(xué)研究的重要技術(shù)手段。近年來，應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)發(fā)表的高水平研究成果越來越多，受到生命科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

但隨著激光共聚焦技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，其在研究中的局限性也突顯出來。激光共聚焦技術(shù)可以視為對熒光技術(shù)的重大改進(jìn)，但并未對熒光技術(shù)作出本質(zhì)改變，因而熒光技術(shù)的固有缺陷也在激光共聚焦技術(shù)上體現(xiàn)出來。首先，激光共聚焦技術(shù)主要獲得的是生物樣品內(nèi)部的離子分子信息，這些離子分子信息的改變既可能源于樣品內(nèi)部離子分子源的變化，也可能源于樣品內(nèi)外的離子分子交換。這兩種離子分子變化過程是由完全不同的生命機(jī)制引發(fā)的。盡管激光共聚焦技術(shù)也可以測量生物樣品外部的離子分子信息，但存在許多問題影響測量的準(zhǔn)確性。這導(dǎo)致共聚焦數(shù)據(jù)的重大缺陷，必須通過大量的后續(xù)實(shí)驗(yàn)才能得出比較準(zhǔn)確的結(jié)論。若單純用激光共聚焦數(shù)據(jù)作為檢測或診斷標(biāo)準(zhǔn)，往往面臨很大的假陽性風(fēng)險。其次，激光共聚焦測量時必須向生物樣品內(nèi)導(dǎo)入熒光物質(zhì)，不僅操作過程復(fù)雜，而且這些熒光物質(zhì)對樣品活性有已知或潛在的影響，甚至可能導(dǎo)致樣品生理狀態(tài)改變，造成數(shù)據(jù)失真。這些問題已經(jīng)成為激光共聚焦技術(shù)發(fā)展的瓶頸，嚴(yán)重制約了它的進(jìn)一步應(yīng)用。

為克服現(xiàn)有激光共聚焦技術(shù)存在的問題，必須使激光共聚焦技術(shù)能夠同時準(zhǔn)確獲得被測樣品內(nèi)外的離子分子信息并盡量減輕測試過程中對樣品的損傷�，F(xiàn)有的激光共聚焦技術(shù)體系要實(shí)現(xiàn)這兩點(diǎn)非常困難，而激光共聚焦技術(shù)與非損傷微測技術(shù)的結(jié)合卻可以輕松做到。

非損傷微測技術(shù)是一大類選擇性/特異性微電極技術(shù)的總稱。1990年，非損傷微測技術(shù)誕生于產(chǎn)生過多為諾貝爾獎獲得者的美國MBL實(shí)驗(yàn)室（2008年諾貝爾化學(xué)獎得主之一下村修曾在該實(shí)驗(yàn)室工作多年）。與其他侵入式測量技術(shù)最大的區(qū)別在于，非損傷微測技術(shù)測試過程由電腦自動控制微電極運(yùn)動，非常接近樣品表面而不接觸樣品進(jìn)行測量，獲得樣品外環(huán)境的離子分子的絕對濃度、流動速率和流動方向的信息。非損傷性測量是非損傷微測技術(shù)的重要特色，測試在與生物樣品真實(shí)生存環(huán)境相似的液體中進(jìn)行，不導(dǎo)入任何外源物質(zhì)，最大程度保證了樣品的生物活性和生理狀態(tài)。也正由于測試過程中微電極不需要接觸樣品，使得非損傷微測技術(shù)被測樣品范圍非常廣泛，從動植物整體、器官、組織、細(xì)胞聚集體、單個細(xì)胞到富集的細(xì)胞器均可。而獲得離子分子的流動速率和流動方向則是非損傷微測技術(shù)的鮮明優(yōu)勢，也是其他技術(shù)手段難以獲得的重要信息。與濃度反映的離子分子靜態(tài)信息相比，流動速率和流動方向反映的則是離子分子動態(tài)信息，樣品外環(huán)境的離子分子流動速率和流動方向?qū)嵸|(zhì)上表征的是樣品內(nèi)外離子分子的交換情況，更能反映生命活動過程的本質(zhì)。除此之外，非損傷微測技術(shù)還具有多電極、長時間、多角度測量等特色。

正因?yàn)榉菗p傷微測技術(shù)的上述優(yōu)勢和特色，自誕生以來便獲得了越來越廣泛的應(yīng)用，迄今已在《Science》、《Nature》等國際著名雜志發(fā)表論文百余篇。非損傷微測技術(shù)所獲取數(shù)據(jù)和激光共聚焦技術(shù)獲取的數(shù)據(jù)有很大互補(bǔ)性，兩者結(jié)合可以同時準(zhǔn)確檢測樣品內(nèi)外離子分子的變化情況，提供生命活動過程的完整信息，明確生命活動機(jī)制機(jī)理。非損傷微測技術(shù)可以測量生命活動中常見的五十多種離子和分子，覆蓋了激光共聚焦技術(shù)的檢測范圍。而非損傷微測技術(shù)在測量時也需要配備顯微鏡，這使非損傷微測技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)的結(jié)合有了硬件基礎(chǔ)。

早在2001年，葡萄牙學(xué)者在《Nature Cell Biology》發(fā)表研究論文，應(yīng)用非損傷微測技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)同時檢測卵細(xì)胞與配子融合過程中卵細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺的變化情況。非損傷微測技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在融合一瞬間，胞外Ca²⁺有一個非常明顯的內(nèi)流，而此時激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Ca²⁺顯著增加，如下圖所示。這充分說明卵細(xì)胞和配子融合過程中胞內(nèi)Ca²⁺的增加源于對胞外Ca²⁺的吸收而非內(nèi)源Ca²⁺釋放，解決了長期懸而未決的科學(xué)難題。

非損傷微測技術(shù)與激光共聚焦技術(shù)同時測量細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺

上述實(shí)例是非損傷微測技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)結(jié)合的濫觴。非損傷微測技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)的結(jié)合瞄準(zhǔn)當(dāng)今生命科學(xué)界以揭示生命活動機(jī)理和功能為主要研究內(nèi)容的潮流，全面反映生命活動的信息，所產(chǎn)出數(shù)據(jù)有很強(qiáng)的說服力，易于產(chǎn)生高水平研究成果。