用UPLC/MS/MS和UPLC/PDA 進(jìn)行三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸分析

Mark E. Benvenuti 和 Aisling O’Connor
沃特世公司，美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德

引言

北美地區(qū)最近出現(xiàn)的寵物食品污染事件突出了對(duì)寵物食品、動(dòng)物飼料以及組織樣品中的三聚氰胺及其代謝物（三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸）進(jìn)行快速、確定性分析的必要性。如 2007 年 5 月 7 日 的《華盛頓郵報(bào)》所述，在美國(guó)，未知數(shù)量的貓狗因食用了某些品牌的寵物食品而患病或死亡。這導(dǎo)致了數(shù)百萬磅寵物食品的召回。在食用了受污染寵物食品的動(dòng)物腎臟內(nèi)，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺 - 三聚氰酸的結(jié)晶體迅速形成；這很可能是動(dòng)物患病甚至死亡的原因。最近，公眾強(qiáng)烈要求制造商和政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)采用更準(zhǔn)確、快速的分析方法進(jìn)行食品安全性檢測(cè)；而此次疾病的突發(fā)使這一呼聲更加高漲。

在證實(shí)了此次污染的廣泛性之后，美國(guó)食品藥品管理局（ FDA ）報(bào)告稱美國(guó)的三聚氰胺存在于面筋和稻米蛋白濃縮物中；這些產(chǎn)品均從中國(guó)進(jìn)口，作為寵物食品使用 1 。動(dòng)物飼料中也受到了三聚氰胺的污染 2 ，這引起了關(guān)于受污染產(chǎn)品可能轉(zhuǎn)移至人類食品供應(yīng)的擔(dān)憂。

本文介紹兩種方法：第一種方法是用于分析高濃度目標(biāo)物質(zhì)的沃特世 ® ACQUITY ® 超高效液相色譜（ UPLC ® ）光電二極管陣列法（ PDA ）；第二種方法是用于分析 ppb 級(jí)濃度的 ACQUITY UPLC ® /MS/MS 法。撰寫本文時(shí)，其中的一種目標(biāo)物質(zhì)“三聚氰酸一酰胺”在市面上買不到；因此，未用上述方法對(duì)其進(jìn)行分析。目前認(rèn)為該化合物與毒性效應(yīng)無關(guān)，因此對(duì)分析過程不重要。兩種方法均可用不到兩分鐘的時(shí)間給出結(jié)果。

結(jié)果和討論

在含水混合液中，三聚氰胺和三聚氰酸可通過氫鍵形成晶格結(jié)構(gòu)。這阻礙了對(duì)包含這兩種化合物的樣品進(jìn)行同步萃取和分析。三聚氰胺不與三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺反應(yīng)；因此可在一次檢測(cè)中，同時(shí)對(duì)這些化合物進(jìn)行萃取和分析。結(jié)果表明：試驗(yàn)部分所述的萃取步驟適用于三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。最近，美國(guó)食品藥品管理局公布了使用 SPE 萃取組織樣品中的三聚氰酸的詳細(xì)方法 3 。

試驗(yàn)

萃取寵物食品中的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的預(yù)備程序

稱量 0.10 -1 g 寵物食品
在 5-10 mL 、 2% 的氫氧化銨溶液中進(jìn)行萃取
用一個(gè) 0.45 微米的注射器式濾器進(jìn)行過濾
將 100 μL 濾液與 900 μL 流動(dòng)相混合后進(jìn)樣

三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸由美國(guó) TCI 公司提供。干狗糧從當(dāng)?shù)氐囊患页�市中�?gòu)得。三聚氰酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液通過加水溶解而制得。三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液通過溶解于 0.1% 的氫氧化鈉水溶液而制得。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用溶于 90/10 乙腈／水的混合溶劑中 10 mM 醋酸銨進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，以配制出所需的濃度水平。

UPLC 的條件

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY UPLC
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC
2.1 x 100 mm 、 1.7 μm
柱溫： 35 ℃
流速： 700 μL/ 分鐘
流動(dòng)相： 溶于 90/10 乙腈／水的 10 mM 醋酸銨
進(jìn)樣量： 5 μL
ACQUITY PDA ： 200 -300 nm

質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY TQD
軟件： 沃特世 MassLynx™ 第 4.1 版
電離模式： ESI 正離子（三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺）
ESI 負(fù)離子（三聚氰酸）
毛細(xì)管電壓： 3 kV
脫溶劑氣： 氮?dú)猓?900 L ／小時(shí)
錐孔氣： 氮?dú)猓?50 L ／小時(shí)
源溫度： 150 ˚C
脫溶劑氣溫度： 400 ˚C
采集： 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（ MRM ）
碰撞氣： 氬氣， 3.5 x 10 -3 毫巴

對(duì)每種化合物采集兩種多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（ MRM ）的躍遷數(shù)據(jù)。主要躍遷用于定量分析，次要躍遷用于確認(rèn)。 MRM 的躍遷、停頓時(shí)間、優(yōu)化后的碰撞能量以及錐孔電壓見表 1 。

表 1. 受監(jiān)測(cè)的 MS/MS 離子躍遷（ ESI 正離子），三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺；（ ESI 負(fù)離子）三聚氰酸

第 1 部分： UPLC /MS/MS 分析

ACQUITY UPLC-TQD 臺(tái)頂式串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀可用不到 1.5 分鐘的時(shí)間完成對(duì)三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分離和確認(rèn)。參見圖 3 。 ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱可給出清晰的峰形，從而可對(duì)寵物食品和面筋型樣品進(jìn)行可信的定量分析。為實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，組織樣品的分析通常需要使用一種同位素標(biāo)記型內(nèi)標(biāo)。本文未對(duì)組織樣品的分析進(jìn)行說明，這是因?yàn)槟壳皼]有適用于這些化合物的同位素標(biāo)記型內(nèi)標(biāo)。

三聚氰酸在另一次檢測(cè)中進(jìn)行分析，所用的色譜條件與三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分析條件相同。圖 4 給出了氰尿酸的一幅 UPLC/MS/MS 色譜圖。

圖 5 給出了萃取得到的一種三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加標(biāo)型干狗糧樣品。沃特世 TargetLynx™ 應(yīng)用管理軟件可自動(dòng)處理數(shù)據(jù)并報(bào)告定量分析結(jié)果；該軟件通過計(jì)算每種化合物的主要和次要 MRM 躍遷之間的離子比，可確定是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。圖 6 給出了關(guān)于三聚氰酸二酰胺的 TargetLynx 瀏覽器界面。

第 2 部分： UPLC/PDA 分析

圖 7 給出了使用 PDA 檢測(cè)型 ACQUITY UPLC 分離三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的加標(biāo)型寵物食品的典型過程，該分離過程需時(shí)不到 1.5 分鐘。該分離使用相同的 ACQUITY BEH HILIC 2.1 x 100 mm 色譜柱，所用的流動(dòng)相構(gòu)成也與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法相同。結(jié)果表明這兩種化合物的校準(zhǔn)曲線在 1-25 ppm 的范圍內(nèi)呈線性。

三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的色譜峰可根據(jù)保留時(shí)間而輕松鑒定，并可通過積分進(jìn)行定量分析。在圖 7 中， 1 分鐘處的未知峰在 221 nm 下出現(xiàn)λ最大值。檢測(cè)三聚氰酸二酰胺的純標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，觀察到一個(gè)具有相近保留時(shí)間和λ最大值的色譜峰；因此認(rèn)定其為三聚氰酸二酰胺的一種雜質(zhì)。緊鄰三聚氰酸二酰胺峰的第二個(gè)未知峰在 236 nm 下出現(xiàn)λ最大值，與未加標(biāo)型狗糧的色譜峰相近。

除了保留時(shí)間的完全匹配之外，通過使用 PDA 和 Empower™ 軟件的 UV 光譜庫(kù)功能，也能提高成分鑒別的可信度。圖 8 和圖 9 分別給出了 10 ppm 三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺標(biāo)準(zhǔn)品以及 10 ppm 三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品的光譜指數(shù)圖。圖 10 給出了一幅用以確認(rèn)三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加標(biāo)型寵物食物樣品的光譜匹配情況的光譜指數(shù)圖

結(jié)論

ACQUITY UPLC - 臺(tái)頂式串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ TQD ）可提供更高的靈敏度和質(zhì)量特異度，從而可用不到 2 分鐘的時(shí)間定量檢出 ppb 水平的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。使用次要的 MRM 離子躍遷可對(duì)加標(biāo)型狗糧中是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺進(jìn)行確認(rèn)。由于存在形成三聚氰胺 - 三聚氰酸結(jié)晶體的風(fēng)險(xiǎn)，因此三聚氰酸在另一次色譜檢測(cè)中進(jìn)行分析。

當(dāng)不需要較高的靈敏度和質(zhì)量特異度時(shí)， ACQUITY UPLC PDA 檢測(cè)可作為 UPLC/MS/MS 的一種快速而劃算的替代方法�？焖俜治鋈�聚氰胺及其代謝物的能力可簡(jiǎn)化與質(zhì)控或產(chǎn)品合規(guī)相關(guān)的工作流程。

參考文獻(xiàn)

1. 《華盛頓郵報(bào)》的網(wǎng)址： http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/ 2007/05/06 /AR2007050601034.html

2. FDA 的網(wǎng)址： http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/petfood.html

3. 在線文章： http:/// ，“用 LC-MS/MS 測(cè)定組織中的三聚氰胺和三聚氰酸的簡(jiǎn)化方法”，由 FDA 方法開發(fā)分部的 Alexander J. Krynitsky 撰寫