牛奶中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的自動化分析

Claude R. Mallet, Dimple D. Shah
Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

簡介

在 1938 年，美國政府通過了聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法令（ FFDCA ， FDCA ，或 FDA ），賦予美國食品和藥品監(jiān)督管理局（ FDA ）督察食品、藥品和化妝品的權(quán)利。如今，美國 FDA 管理著除了美國農(nóng)業(yè)部管理的肉類、家禽肉和某些奶制品之外的國內(nèi)和進口的所有食品�，F(xiàn)在，所有的牛奶都要由 FDA 、美國政府和牛奶生產(chǎn)商共同努力監(jiān)控藥物殘留。在 2007 年的財政年報 1 中，有超過 400 萬的樣品都要分析廣大范圍的抗生素，如內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素。例如，美國 FDA 建議牛奶中某種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素替米考星的最大殘留量（ MRL ） 50ug/kg ，這個標(biāo)準(zhǔn)也被歐盟接受。許多國家都遵從美國食品和農(nóng)業(yè)聯(lián)合組織 / 世界衛(wèi)生組織（ WHO ）的 40 μ g/kg 的最大殘留量，而不是為每種藥物設(shè)置各自的最大殘留量。

大環(huán)內(nèi)酯類是一組藥物，它的活性來源于大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的存在，而大環(huán)內(nèi)酯環(huán)上有可能有一個或多個脫氧糖，經(jīng)常為二脫氧甲基已糖和脫氧糖胺。內(nèi)酯經(jīng)常是 14- 、 15- 或 16- 環(huán)的。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)藥物，以治療許多疾病，例如哺乳期奶牛的呼吸道疾病、臨床癥狀不顯的乳腺炎，或者它們可以被作為飼料添加劑以促進生長。如果牛奶提取期太短，抗生素殘留可能仍然存在，可對消費者帶來直接的毒副作用（過敏反應(yīng)） 2 。

圖 1 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

離線的 SPE 萃取方案

傳統(tǒng)上，微生物檢測 3 被用來監(jiān)測食品基質(zhì)中的抗生素。這些方案都有很好的定量結(jié)果，但越來越缺乏高度的專屬性。隨著現(xiàn)代實驗室 LC/MS 或 LC/MS/MS 系統(tǒng)的普遍使用，多殘留方法是更被常規(guī)工作所認可的方法。

包含食品基質(zhì)的分析方案通常是很復(fù)雜的，需要數(shù)個小時的手動操作。例如，飲用水方案（較低的樣品復(fù)雜度）由下列步驟組成：直接上樣到 SPE 小柱、少量的清洗步驟、洗脫，以及最后的蒸干和用流動相復(fù)溶。象食品樣品之類的固體基質(zhì)（較高的樣品復(fù)雜度）必須先用水溶液或有機提取緩沖液均質(zhì)提取，然后是一些離心步驟、液液萃�。�可選項），最后在實施 SPE 萃取方案前用水溶液稀釋。關(guān)于牛奶分析，最常用的萃取方案是用乙腈沉淀蛋白 4 。混合物然后離心數(shù)分鐘。上清液可以用其它的萃取技術(shù)進一步提純。

離線的 SPE 牛奶方案

步驟 1 ： 加入 5mL 的牛奶到 50-mL 的離心管中
步驟 2 ： 加入 15mL 的乙腈
步驟 3 ： 渦旋并在 3200RPM 轉(zhuǎn)速下離心 15min
步驟 4 ： 轉(zhuǎn)移上清液到 50-mL 的離心管中
步驟 5 ： 加入 20mL 的正己烷
步驟 6 ： 渦旋 15min
步驟 7 ： 在 3200RPM 轉(zhuǎn)速下離心 15min
步驟 8 ： 移去正己烷層
步驟 9 ： 蒸發(fā)乙腈 / 牛奶上清液到 3mL
步驟 10 ： 加入 15mL 0.1M 、 PH 為 8.0 的硫酸鹽緩沖液
步驟 11 ： 用 10mL 的甲醇活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步驟 12 ： 用 10mL 的水活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步驟 13 ： 用 10mL2% 的 NaCl 活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步驟 14 ： 用 2mL 0.1M 、 PH 值為 8.0 的磷酸鹽活化 Oasis®HLB （ 6cc ）
步驟 15 ： 上載復(fù)溶的樣品（步驟 10 ）
步驟 16 ： 用 5mL 的水清洗
步驟 17 ： 用 5mL40% 的甲醇水溶液清洗
步驟 18 ： 使 Oasis HLB 流干 5min
步驟 19 ： 用 5mL95% 的甲醇水溶液洗脫
步驟 20 ： 蒸發(fā)近干（ 45min ）
步驟 21 ： 用 1mL 的初始條件流動相復(fù)溶
步驟 22 ： 用 0.45 μ m 的聚偏二乙烯氟化物（ PVDF ）過濾萃取物

在線的 SPE 萃取方案

以前的出版物（在線 SPE/LC/MS/MS 部分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）介紹了新穎的自動化萃取 / 分析技術(shù)： Waters AquaAnalysis 系統(tǒng)�？傮w解決平臺帶來了多種好處：減少手工操作、減少溶劑消耗和減少樣品體積。使用在線的 SPE/LC/MS/MS 技術(shù)平臺省去了消耗時間的蒸干 / 復(fù)溶步驟。

在線的 SPE/LC/MS/MS 技術(shù)不僅僅適合于飲用水分析。飲用水樣品可直接上樣到自動進樣器，然后就是完全自動化的電腦控制的萃取 / 分析步驟。對于食品分析，固體樣品要先轉(zhuǎn)變成液體形式。分析開始于均質(zhì)化以釋放被束縛的分析物到液相萃取緩沖液。均質(zhì)化需要經(jīng)過離心步驟，然后上清液被轉(zhuǎn)移出來。在這時，目標(biāo)分析物以合適的形式存在，以便于其它的凈化、濃縮或萃取步驟，例如，液液提取（ LLE ）和 SPE 。通過使用軟件控制下的在線 SPE 方案，食品樣品的萃取 / 分析過程現(xiàn)在僅需要均質(zhì)化、離心和稀釋步驟。

在線的 SPE 牛奶方案

步驟 1 ： 加入 1mL 牛奶到 50mL 的離心管中
步驟 2 ： 加入 20ul 一定濃度的氨水
步驟 3 ： 加入 2ml 的乙腈（ 2:1 的比例）
步驟 4 ： 渦旋并在 3500RPM 的轉(zhuǎn)速下離心 15min
步驟 5 ： 轉(zhuǎn)移 2mL 的上清液到 20ml 的進樣瓶
步驟 6 ： 加入 18mL 的水
步驟 7 ： 進樣 5mL

實驗

大環(huán)內(nèi)酯所用的 MRM 條件都列在了表 1 中。使用的 SPE 萃取柱是 Waters® Oasia HLB 2.1x 20 mm ， 25 μ m ，中性 pH 值上樣，流動相（無添加物 ) ）。使用的分析柱是 XBridgeTMC18 2.1x 50 mm 3.5 μ m ，低 pH 值流動相洗脫。清洗和再活化參數(shù)都列在了下面。

SPE 和 LC 工作條件

載樣泵： 管路 A:100% 水
管路 B ： 100% 甲醇
載樣流速： 4.0 mL/min
清洗液： 20% 的甲醇 / 乙腈（ 30/70 ） +0.5% 甲酸
再平衡泵： A ： 50/50 的甲醇 / 丙酮
B ： 80/20 的乙酸乙酯 / 丙酮
C ： 80/20 的正己烷 / 丙酮
再平衡流速： 4.0 mL/min
萃取柱： Oasis HLB 2.1x 2 mm ， 25.0 μ m
分析柱： XBridge C18 2.1x 50 mm ， 3.5 μ m

結(jié)果和討論

圖 2 為添加了 0.5ppb 每種抗生素的牛奶樣品的具有代表性的提取離子色譜圖�？股�素在微量水平都具有良好的信號和峰形。對于食品樣品，樣品的復(fù)雜度要高于飲用水樣品，而且清洗步驟需要優(yōu)化以最大程度的清除干擾物質(zhì)，而不洗脫掉所感興趣的分析物。圖 3 為添加了 100ppb 紅霉素，分別用 5% 、 10% 、 20% 、 30% 和 40% 甲醇清洗的色譜圖。在圖 2 中， 20% 甲醇清洗與 5% 甲醇清洗相比，會產(chǎn)生更高的信號。 5% 甲醇的弱信號可歸因于離子抑制效應(yīng)�？墒�，當(dāng)清洗步驟中的有機相比例增加的過多時，信號的靈敏度由于部分洗脫而有下降趨勢。

圖 4 為紅霉素濃度從 1.0ppb 到 500.0ppb 、線性系數(shù)為 0.9902 的校正曲線圖。表 2 是在線和離線 SPE 萃取方案肩并肩的對比，從文獻到處理天然的牛奶樣品到適于 LC/MS 或 GC/MS 分析的理想形態(tài)。當(dāng)評價在線 SPE/LC/MS/MS 和離線方案時，通常的萃取程序和溶劑、實驗室人員和時間的整體應(yīng)用都是很重要的。其它的食品樣品有各種各樣的結(jié)構(gòu)，在 SPE 萃取前可能需要其它的處理程序。例如，牛奶樣品在用 SPE 裝置進一步凈化前需要簡單的蛋白沉淀和離心。對于像

圖 2 添加了 0.5ppb 的牛奶的提取離子色譜圖

圖 3 牛奶提取的優(yōu)化清洗

圖 4 紅霉素的校正曲線

水果和蔬菜這樣的固體樣品，使用萃取緩沖液的低溫碾磨或均質(zhì)化步驟是優(yōu)先考慮的方法。對于通常的萃取程序，很容易找到每個萃取步驟都使用廣大范圍的體積和時間的文獻報道。通常，使用 SPE 方案，上樣、清洗和洗脫體積都根據(jù) SPE 裝置的床臺尺寸估量。這可以首先保證在每個步驟中 SP E 吸附劑的整體潤濕。一旦這個數(shù)值定下來，這可以增加數(shù)倍 ( 依賴于化合物 ) 確保多個體積置換以使清洗步驟最小化清除干擾和洗脫步驟最大化回收率。在實際的操作中，柱床上樣量誘捕能力的增加需要 SPE 程序中體積的增加；這最終會增加樣品制備時間和溶劑消耗量。

結(jié)論

在過去的這些年里，許多國家已經(jīng)盡了很大努力來進一步提高他們的國內(nèi)和進口的食品供應(yīng)的安全性，以使消費者能夠享受安全的食品供應(yīng)。正因為這樣，許多分析方法都可以得到，并在常規(guī)的分析中被使用。隨著最小化溶劑使用量和最大化實驗室人員使用的需求增

加，自動化平臺的使用絕對會滿足這些要求。這篇應(yīng)用文獻描述了牛奶樣品中抗生素的自動化萃取和分析。傳統(tǒng)的萃取前處理步驟是極其消耗時間的；他們需要更大數(shù)量的化學(xué)品和各種各樣的試劑。使用 Waters AquaAnalysis 系統(tǒng)處理牛奶樣品的時間大約為 20min ，這與離線方案相比可以減少 70-90% 的時間。

表 2 牛奶樣品的離線和在線萃取方案的溶劑消耗量和處理時間

參考文獻

[1] U.S. FDA National Milk Drug Residue Database. Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Drug Administration, 2007.
Available online: http://www.cfsan.fda.gov/~ear/p-mis.html
[2] W A Moats, M B Medina. Veterinary Drug Residues, ACS Symposium Series 636, American Chemical Society, Washington, DC, 1996, p.5.
[3] 43rd Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food, WHO Tech. Rep Ser., No 855, 1995, p.85.
[4] J Wang, D Leung, S P Lenz. J. Agric. Food Chem. 54: 2873, 2006.|
[5] M Dubois, D Fluchard, E Sior, P H Delahaut. J. Chromatogr. B.753: 189, 2001.
[6] S B Turnipseed, W C Andersen, C M Karbiwnyk, M R Madson, K E Miller. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22: 1467, 2008.