高分辨率熔點分析技術(shù)進行凍存組織樣本甲基化的檢測
羅氏癌癥研究應(yīng)用：高分辨率熔點分析技術(shù)進行凍存組織樣本甲基化的檢測
1 前言
啟動子高度甲基化是惡性腫瘤基因轉(zhuǎn)錄中的一種很常見的現(xiàn)象，被視為細胞惡性轉(zhuǎn)化的標志之一。DNA甲基化分析是一種基因檢測工具，用于早期癌癥檢測、風險評估與治療療效評估，具有非常誘人的前景。
DNA甲基化檢測最常用的方法主要依賴于亞硫酸氫鈉對基因組 DNA 的處理，將胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，未修飾5-甲基胞嘧啶。經(jīng)過修飾的基因序列發(fā)生改變，可對后續(xù)的 PCR 擴增產(chǎn)物中的甲基化胞嘧啶進行鑒別。
通過亞硫酸測序分析，可對基因甲基化情況進行最準確的評估，可鑒定單甲基化胞嘧啶。并開發(fā)出了幾種更加簡單的以 PCR為基礎(chǔ)的方法，這些方法對于小規(guī)模的研究性實驗室來說，非常重要。這些方法較新、較簡單、容易操作。高分辨率熔點分析方法（HRM）即是這幾種方法之一。HRM 是基于溶液中 DNA 的“熔解”特性。該方法的原理是，通過基于不同熔解溫度的熔點分析，區(qū)分出具有不同甲基化胞嘧啶含量的雙硫酸處理的 DNA 模板。由于不需要昂貴的探針與內(nèi)參基因進行標準化處理，HRM 是一種相對簡單，而成本又較低的方法。通過 HRM 技術(shù)的應(yīng)用，可對擴增子內(nèi)所有 CpGs 進行分析，根據(jù)熔解曲線的形狀，可對同源性及異源性甲基化進行區(qū)分。這一點非常重要，因為啟動子 CpG 島的甲基化模式通常為非同源性。
對于生物標志物檢測來說，凍存組織是一種非常重要的資源。于福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織上，對主要分析方法的性能進行了檢測。當前研究的目的，是對結(jié)直腸癌個體凍存 FFPE 組織上啟動子甲基化檢測 HRM 分析進行評價及確證。
2 材料與方法
2.1 對照與研究樣本
將CpGenome通用甲基化DNA（Chemicon/Millipore,Billerica, MA）與來自外周血單個核細胞（PBMNCs）DNA 作為甲基化與非甲基化對照。于非甲基化 PBMC DNA 中對甲基化對照 DNA 進行稀釋處理，生成甲基化標準品（50%、25%、10%、5%、1% 與 0.1%）。HRM 檢測優(yōu)化后，我們對來自于結(jié)直腸腫瘤個體的凍存組織樣本進行了分析。
2.2 DNA提取與雙硫酸修飾
對來自于培養(yǎng)腫瘤細胞系的健康志愿者PBMNC DNA與DNA 進行分離。對于來自于凍存研究組織的DNA分離物來說，使用的是來自于FFPE 腫瘤組織塊的10 μm 厚度的切片。
2.3 MethyLight 檢測
有關(guān)MGMT與APC MethyLight檢測說明，見前期文獻描述。簡言之，于LightCycler® 480儀器上進行PCR。
2.4 高分辨率熔點分析
于LightCycler® 480儀器（羅氏）上進行PCR擴增與HRM。考慮到FFPE DNA呈高度片段化，大的擴增子會導致熔點分辨率降低，擴增子被設(shè)計為不超出200bp。
使用Gene Scanning與TM Calling軟件模塊（羅氏）進行HRM數(shù)據(jù)分析。通過對代表著PCR產(chǎn)物熔解前及熔解后兩個標準化區(qū)域的計算，對熔解曲線進行標準化處理。通過這種計算，可對具有不同起始熒光強度的樣本進行直接比較。標準化溫度轉(zhuǎn)換熔解曲線圖顯示，隨著溫度升高， 熒光強度降低。
3 結(jié)果與討論
對標準稀釋品進行檢測，測定HRM檢測的靈敏性。通過所有HRM檢測（APC、MGMT、GSPT1和PTEN），我們可以在保證重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，于非甲基化DNA背景中，檢測到1% 的甲基化的DNA（圖1A-D）。
圖 1：MGMT（A）、APC（B）、GSTP1（C）與 PTEN（D）甲基化 HRM檢測靈敏性。
以三種方式顯示甲基化標準曲線。100 % 甲基化顯示為紅色、50 % 甲基化顯示為橙色、25 % 甲基化顯示為綠色、10 % 甲基化顯示為藍綠色、1% 甲基化顯示為黃色、0.1% 甲基化顯示為紫色，0 % 甲基化顯示為藍色。
下一步，我們對福爾馬林固定、是蠟包埋處理對啟動子高度甲基化檢測的作用進行了評價。我們能夠?qū)?APC啟動子高度甲基化進行檢測，檢測可靠性較高。圖2（A–C）顯示，新鮮與FFPE細胞系DNA APC HRM檢測重現(xiàn)性與一致性較近似。
圖 2：使用來自于不同腫瘤細胞系--甲基化標準品（黑色曲線、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）與樣本（彩色曲線）均呈三重顯示。甲基化標準品（黑色曲線、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）與樣本（彩色曲線）均呈三重顯示。（C）來自于 8 份乳腺癌與前列腺癌細胞系的新鮮與 FFPE 腫瘤細胞系 DNA APC HRM 檢測的批間變異性。條形圖代表6個獨立性實驗的平均值及標準差。
FFPE組織啟動子HRM甲基化分析具有以下潛在應(yīng)用前景。對具有淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤甲基化的確定，不僅可闡明疾病進展過程中發(fā)生的表觀遺傳學事件，而且可輔助確定石蠟包埋組織樣本的預測性標志物。
4 結(jié)論
我們的研究進一步證實了FFPE組織啟動子甲基化分析定量HRM的適用性。FFPE組織是正常對照與病變組織最大的樣本材料來源，這些組織的應(yīng)用，對于研究來說具有不可估量的價值。方法學評價對于實驗穩(wěn)定性的確證非常重要，可輔助確立該檢測方法是否適合作為一種研究工具以及可能的常規(guī)檢測手段。
“三好一快”的羅氏LightCycler® 480實時定量PCR系統(tǒng)
全新體驗謀求突破，創(chuàng)新設(shè)計詮釋經(jīng)典！
LightCycler® 480是羅氏公司經(jīng)過十多年不斷的創(chuàng)新和積累，精心打造的經(jīng)典款全自動可變通量的實時熒光PCR系統(tǒng)，系統(tǒng)包含溫控模塊、氙燈光源、光學檢測系統(tǒng)、配套試劑耗材、以及專用的數(shù)據(jù)采集及分析軟件。其集靈活、快速、精準于一體，為基因表達和遺傳分析提供了高效的科研和診斷平臺。
溫控好：儀器的溫控系統(tǒng)引入了具有獨家專利的Therma-baseTM技術(shù)，在加熱和冷卻元件之間引入的高效液體導熱層，其無與倫比的孔間溫度均一性可達±0.1℃，是目前板式實時定量PCR中最高水平，保證了良好的重復性和數(shù)據(jù)的均一性，可達到單拷貝檢出的靈敏度，覆蓋多達11個數(shù)量級的動力學范圍，并能準確區(qū)分出低至1000和2000拷貝的濃度差異，同時可實現(xiàn)HRM高分辨率熔解曲線分析技術(shù)的高級應(yīng)用。
光源好：使用寬光譜、高強度的氙燈作為光源，實現(xiàn)最佳的熒光激發(fā)效率。配合獨有的五棱反射光學系統(tǒng)，有效加長光程，可以顯著消除同類儀器普遍存在的邊緣效應(yīng)。并選用冷CCD以保證了最高的檢測靈敏度。
檢測好：通過激發(fā)波長和發(fā)射波長的任意組合，與實時熒光PCR實驗中常見的熒光染料完全兼容，讓您自由選擇任意分析模式。配套軟件操作簡便，界面友好，讓用戶能夠輕松、省時地處理高通量的實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析模式可靈活切換，支持絕對定量、熔解曲線、相對定量、自動基因分型和高分辨率熔解曲線分析等功能。羅氏獨特的PCR擴增效率校正（E-Method）算法保證實驗精確度，符合國際公認的MIQE標準。
反應(yīng)快：384孔板完成40個循環(huán)的時間少于50分鐘，96孔板完成40個循環(huán)的時間少于30分鐘。
羅氏公司同時提供多種系列檢測試劑盒--LightCycler® 480 SYBRⅠMaster, LightCycler® 480 Probe Master, LightCycler® 480 Genotyping Master,
LightCycler® 480 HRM Master等，廣泛適用于核酸定量、基因表達、基因分型、甲基化分析、突變位點篩查、芯片檢測驗證以及SNP位點發(fā)現(xiàn)等多種領(lǐng)域，并獲得國家食藥監(jiān)局SFDA醫(yī)療器械注冊證。迄今為止，已經(jīng)發(fā)表超過25,000篇相關(guān)文獻報道。
LightCycler® 480 HRM Master等，廣泛適用于核酸定量、基因表達、基因分型、甲基化分析、突變位點篩查、芯片檢測驗證以及SNP位點發(fā)現(xiàn)等多種領(lǐng)域，并獲得國家食藥監(jiān)局SFDA醫(yī)療器械注冊證。迄今為止，已經(jīng)發(fā)表超過25,000篇相關(guān)文獻報道。 羅氏強大的市場銷售團隊、技術(shù)支持和工程師團隊遍布于全中國，坐落于上�？偛康膩喬珔^(qū)技術(shù)支持中心，通過免費的技術(shù)服務(wù)熱線，第一時間響應(yīng)您在使用過程中需要解答的任何問題，提供優(yōu)越的售前產(chǎn)品咨詢、售后技術(shù)支持的全程服務(wù)，以最佳的解決方案加速您的研究進程。直觀專業(yè)的培訓教程，手把手引導您快速進入角色，成為實時熒光定量PCR軟硬件操作的專家。
羅氏LightCycler® 480實時熒光PCR系統(tǒng)：操作便捷，結(jié)果準確，重復性高，是您進行實時熒光PCR實驗的明智之選。
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com