離心技術(shù)的類型

離心技術(shù)的類型

最大速度方法
(1)移動(dòng)界面超速離心法
含幾個(gè)組分的樣品在足夠高的離心場(chǎng)中離心時(shí)，每種顆粒都達(dá)到其最大沉降速度，這時(shí)樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，并形成對(duì)應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動(dòng)相對(duì)于每種組分來說是特征的。

雖然利用這種方法不一定能實(shí)現(xiàn)組分的純化分離，但可以通過監(jiān)測(cè)界面的移動(dòng)來測(cè)定各組分的沉降速度。要想實(shí)現(xiàn)組分間的分離，必須在所需樣品沉降之后停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，并以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經(jīng)過反復(fù)多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法，它對(duì)細(xì)胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉(zhuǎn)速的方法實(shí)現(xiàn)不同組分間的分離，如圖2－36。

圖2－36 細(xì)胞勻漿差示分離的示意圖
(a)細(xì)胞勻漿；(b)細(xì)胞碎片；(c)線粒體、過氧化物酶體、溶酶體；(d)微粒體、核糖體；(e)細(xì)胞液；(可溶性蛋白質(zhì)及小分子生物)
(2)移動(dòng)區(qū)帶超速離心法
差示離心法離心前各組分均勻分布在整個(gè)溶液中，所以分離一般不理想，而移動(dòng)區(qū)帶超速離心法是一種密度梯度(Dens 心Gradient)離心技術(shù)，在離心之前離心管中溶液的密度不同(從上到下密度增大)，梯度介質(zhì)中最大密度應(yīng)小于樣品物質(zhì)的最小密度，其特點(diǎn)是物質(zhì)的分離取決于樣品物質(zhì)顆粒的質(zhì)量．即樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)，而不是取決于樣品物質(zhì)的密度，因而適合于分離密度相近而大小和形狀不同的物質(zhì)，這屬于一種非平衡態(tài)分離法。當(dāng)樣品物質(zhì)輕輕地鋪在密度梯度介質(zhì)的液面上，起動(dòng)離心機(jī)，在離心力的作用下，一定時(shí)間后便形成不同物質(zhì)的區(qū)帶。當(dāng)繼續(xù)離心時(shí)每個(gè)區(qū)帶會(huì)逐一達(dá)到管底，所以，在沉降最快的區(qū)帶到達(dá)管底之前要停止離心，并將每個(gè)區(qū)帶分部收集。最常用的制備密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化銫和硫酸銫等。
等密度方法
等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質(zhì)的密度相等，實(shí)際上是在梯度密度介質(zhì)中進(jìn)行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是沉降分離與樣品物質(zhì)的大小和形狀無關(guān)，而取決于樣品物質(zhì)的密度。這種方法非常類似于電泳中的PH 梯度等電聚焦方法，在離心時(shí)，顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移動(dòng)到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止，其結(jié)果是依樣品物質(zhì)密度的不同在梯度溶劑中形成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。
在實(shí)驗(yàn)方法上可以采用預(yù)先制備密度梯度溶液的方法，一般先制備兩種儲(chǔ)備液，它們的濃度決定最終所形成梯度溶液的極限�？梢酝ㄟ^分步減小密度，從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續(xù)梯度溶液，也可以通過一個(gè)梯度混合器產(chǎn)生連續(xù)梯度密度。儲(chǔ)備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來制備。樣品一般鋪在溶液的表面，然后開始離心。
在實(shí)驗(yàn)方法上也可以采用平衡密度梯度法，在這種離心法中，介質(zhì)的梯度不是預(yù)先配制，而是在離心過程中，由于離心力的作用而逐漸形成。樣品物質(zhì)和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻，離心開始之后，銫鹽由于離心力的作用，自離心管口至離心管底形成連續(xù)遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質(zhì)在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區(qū)帶，不同的物質(zhì)最終到達(dá)相應(yīng)的區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種方法依賴于在離心場(chǎng)的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成，一般需要長時(shí)間的離心(2~3天)。顯然，樣品物質(zhì)的密度應(yīng)介于介質(zhì)梯度中最大和最小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。
無論是采用哪種操作方式，最終都要分別收集處在每一區(qū)帶的樣品組分，一般可采用下述兩種方法實(shí)現(xiàn)：
(1)穿刺法
這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi)，不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出，然后用部分收集器分別收集。
(2)取代法
在離心管口加一個(gè)帶有收集導(dǎo)管的塞子，塞子上同時(shí)裝有一根輸液導(dǎo)管插入離心管的管底，從輸液管中注入高密度的離心介質(zhì)．其密度高于離心管中所形成的最大密度。當(dāng)取代液不斷注入時(shí)離心管中的溶液逐漸上升，并不斷從收集導(dǎo)管中流出，然后用部分收集器分別收集。
離心機(jī)類型
通常所使用的離心機(jī)根據(jù)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速大小的不同可分為普通離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)三類。
(1)普通離心機(jī)
一般來說，最大轉(zhuǎn)速不超過6000r／min 者屬普通離心機(jī)；如國產(chǎn)的80—1型，LXJ—Ⅱ型等。離心機(jī)轉(zhuǎn)速與相對(duì)離心力的測(cè)算，如圖2—37。
普通離心機(jī)轉(zhuǎn)子在室溫下運(yùn)轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度一般無法控制，轉(zhuǎn)子有固定角度式和懸掛吊格式。
離心時(shí)形成的固體沉淀層叫壓板，液相部分稱之為上層清液。用傾注法分離兩相。
(2)高速離心機(jī)
轉(zhuǎn)速可以達(dá)到25000r／min 者為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速在25000r／min 以上者為超速離心機(jī)。高速離心機(jī)一般帶有制冷裝置，因而轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度可以控制。轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度一般控制在4℃為宜。。其中大容量連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)的主要用途是從大量培養(yǎng)物(5~500 L)中收集酵母及細(xì)菌等。另一類是低容量冰凍離心機(jī)，型號(hào)甚多，其最大容量可達(dá)3L。這類離心機(jī)有各種內(nèi)部可變換的角式和甩平式轉(zhuǎn)頭，它們多用于收集微生物、細(xì)胞碎片、細(xì)胞、大的細(xì)胞器、硫酸銨沉淀物、免疫沉淀物酶的粗提液等。特別需注意的是，每次離心前，應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)頭型號(hào)和樣品多少，設(shè)置樣品高度。
(3)超高速離心機(jī)
普通和高速離心機(jī)主要用于分離制備生物大分子物質(zhì)和亞細(xì)胞成分；超速離心機(jī)有超過500000×g的離心力，能使亞細(xì)胞器分級(jí)分離，可用于分離病毒，也可用于測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸的相對(duì)分子質(zhì)量等。
根據(jù)功能不同，又可分制備性超速離心機(jī)和分析性超速離心機(jī)。
由于轉(zhuǎn)速高會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，因而這種離心機(jī)都附有冷凍裝置，以降低轉(zhuǎn)子室內(nèi)溫度。同時(shí)．轉(zhuǎn)子是在真空下運(yùn)轉(zhuǎn)的，可以減小摩擦。分析性離心時(shí)，必須對(duì)固相顆粒沉降過程跟蹤監(jiān)測(cè)。為此，超速離心機(jī)附有一套光學(xué)系統(tǒng)，光路與離心管垂直，并透過離心管內(nèi)的溶液，同時(shí)測(cè)定光密度或透光率，也可以檢測(cè)沉降顆粒的沉降速度和移動(dòng)界面。這些測(cè)定有助于對(duì)樣品的狀況進(jìn)行分析。

①制備性超速離心機(jī)：
主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。
驅(qū)動(dòng)和速度控制：大多數(shù)超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻馬達(dá)連接到轉(zhuǎn)頭軸構(gòu)成。由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑僅僅 0.476cm，這樣，在旋轉(zhuǎn)期間細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以便適應(yīng)轉(zhuǎn)頭的輕度不平衡，而不至于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)鈾損傷。利用變阻器和帶有旋速器的控制器來選擇轉(zhuǎn)頭的轉(zhuǎn)速。除速度控制系統(tǒng)以外，還有一個(gè)過速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速時(shí)引起的轉(zhuǎn)頭撕裂或爆炸。為此目的，離心腔總是用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制：其溫度控制是由安置在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接而連續(xù)地監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)頭的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控。

真空系統(tǒng)：當(dāng)轉(zhuǎn)速超過4000 r／min 時(shí)，空氣與旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)軸之間的摩擦生熱成為嚴(yán)重的問題。為了消除這種熱源．超速離心機(jī)一般增添了真空系統(tǒng)。將離心腔密封，并通過兩個(gè)串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空。第一個(gè)工作泵與一般實(shí)驗(yàn)室的機(jī)械真空泵相同，它可抽真空到13．33~666Pa。一旦離心腔內(nèi)的壓力減低到33．33Pa 以下，水冷擴(kuò)散泵也開始工作。利用這兩個(gè)泵，可使真空度達(dá)到并維持在0．13~0．26Pa。在摩擦力降低的情況下，速度才有可能升高到所需的轉(zhuǎn)數(shù)。

轉(zhuǎn)頭：制備性超速離心機(jī)采用的轉(zhuǎn)頭有各種各樣．一般可分為兩大類：角式轉(zhuǎn)頭和甩平式轉(zhuǎn)頭。角式轉(zhuǎn)頭的孔穴與旋轉(zhuǎn)軸心之間的角度在20~45度之間。這類轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，速度較高。另一種甩平式轉(zhuǎn)頭則由一個(gè)轉(zhuǎn)頭上懸吊著6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶〔離心管套〕構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，這些吊柄垂直懸掛；當(dāng)轉(zhuǎn)頭在離心力的作用下轉(zhuǎn)速達(dá)到200～800 r／min 時(shí)．吊桶即甩平到水平位置。

這種轉(zhuǎn)頭主要是為了密度梯度沉降法而設(shè)計(jì)的。其主要優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，而離心時(shí)管子保持水平。在水平位置沉降到離心管不同區(qū)域的樣品呈現(xiàn)出橫過離心管的帶狀，而不像角式轉(zhuǎn)頭中那樣成角度。因此，當(dāng)從轉(zhuǎn)頭中取出離心管時(shí)．不會(huì)像在角式轉(zhuǎn)頭中那樣，沉降成分重新定位。這類轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是：形成區(qū)帶所需的時(shí)間間矩長，②分析性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)的沉降過程。

分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，此轉(zhuǎn)頭通過一個(gè)有天性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上。轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的膠中旋轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)頭上有2~6個(gè)裝離心杯的小室，離心杯呈扇形，可上下透光。離心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì)。在預(yù)定的時(shí)間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片、杯中物質(zhì)沉降過程中，重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個(gè)”峰”，出于沉降不斷進(jìn)行，界面問前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)。從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。
分析性超速離心機(jī)主要用于生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，估算樣艙的純度和檢測(cè)生物大分子構(gòu)象的變化等。