超濾技術(shù)在制藥工業(yè)中除熱原的應(yīng)用

超濾技術(shù)在制藥工業(yè)中除熱原的應(yīng)用
《膜科學(xué)與技術(shù)》1999年第19卷第3期

樓福樂(lè)  毛偉鋼  陸曉峰  梁國(guó)明

（中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所，上海  201800）

陸文達(dá)  黃梅菊

（上海福達(dá)藥業(yè)有限公司，上海  201400）

 

摘  要    介紹了熱原的本質(zhì)，它的定量表示及測(cè)定方法。隨著膜分離技術(shù)的快速發(fā)展，采用超濾法去除注射液中的熱原已在醫(yī)藥行業(yè)實(shí)際應(yīng)用。列舉了國(guó)外多項(xiàng)應(yīng)用實(shí)例，并介紹了中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所生產(chǎn)的卷式超濾裝置在藥液除熱原工藝中的使用情況。

關(guān)鍵詞    熱原  超濾  卷式超濾裝置

分類號(hào)    TQ028.8

 

隨著膜分離技術(shù)的迅速發(fā)展，在制藥工業(yè)中應(yīng)用超濾膜分離工藝除去（或降低）注射用藥物（藥液）中熱原含量，使之符合藥典規(guī)定，正在日益廣泛的應(yīng)用。例如日本、美國(guó)藥典允許大輸液除熱原采用反滲透和超濾單元。而國(guó)內(nèi)也正在探索和尋求用國(guó)產(chǎn)超濾設(shè)備去除熱原的方法和工藝。中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所研制、生產(chǎn)出多種材質(zhì)和規(guī)格的超濾膜以及板框式和卷式超濾系列設(shè)備，已在許多領(lǐng)域應(yīng)用，為了在制藥工業(yè)除熱原項(xiàng)目的推廣使用，筆者在有關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研基礎(chǔ)上進(jìn)行了應(yīng)用試驗(yàn)工作，并取得成功，從而促進(jìn)超濾法除藥液中熱原這一工藝得到應(yīng)用開(kāi)發(fā)。

M.Thmas等^[1]指出，熱原（Pyrogen）又稱內(nèi)毒素（Endotoxin）,產(chǎn)生于革藍(lán)氏陰性（Gram-nagative）細(xì)菌的細(xì)胞外璧，亦即細(xì)菌尸體的碎片。它是一種脂多糖物質(zhì)（Lipopoly-saccharide），簡(jiǎn)稱LPS，其相對(duì)分子質(zhì)量從幾千到幾十萬(wàn)不等，根據(jù)產(chǎn)生它的細(xì)菌種類而定。在水溶液中，其相對(duì)分子質(zhì)量可為幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等。最近已揭示了類脂A（Lipid）也是熱原物質(zhì)，構(gòu)成為危害人體的內(nèi)毒素，相對(duì)分子質(zhì)量大約為2000。

永田彥等指出^[2]，發(fā)熱性物質(zhì)即熱原有兩類：一類是低相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)熱物質(zhì).

收稿日期：1998-10-12；修改稿收到日期：1998-11-23

第一作者：男，56歲，高級(jí)工程師.

（Pyretice），另一類是高相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)熱物質(zhì)（Pyrogen），它們統(tǒng)稱為內(nèi)毒素。一般認(rèn)為熱原是指細(xì)菌發(fā)熱物質(zhì)，它由革藍(lán)氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的外膜構(gòu)成。更進(jìn)一步分析其主要成份是脂多糖（LPS）及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對(duì)分子質(zhì)量一般為1萬(wàn)～2.5萬(wàn)，在水溶液中形成締合體，相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)50萬(wàn)～100萬(wàn)。這類物質(zhì)具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被除滅。

加熱溫度℃	LPS失活時(shí)間/min
250	30以上
200	60以上
180	120以上

熱原可以用濃度來(lái)定量標(biāo)度。文獻(xiàn)大都以每毫升克數(shù)為濃度單位，一般單位為ng/ml，即10^-9g/ml，或pg/ml，即10^-12g/ml。也有采用EU/ml為熱原單位。我國(guó)1998年藥典確定用EU/ml為熱原單位。兩個(gè)單位之間的換算關(guān)系比較復(fù)雜，因?yàn)閬?lái)自不同種類細(xì)菌的熱原毒性表現(xiàn)不盡一致。美國(guó)有關(guān)部門(mén)對(duì)大量試樣數(shù)據(jù)采用概率統(tǒng)計(jì)方法提出如下結(jié)果：對(duì)EC₂類細(xì)菌1ng/ml＝5EU/ml；類細(xì)菌1ng/ml＝10EU/ml。日本藥檢部門(mén)報(bào)告對(duì)EKT類細(xì)菌1ng/ml＝8EU/ml。

熱原的分析、測(cè)定方法主要有鱟試劑法和家兔法。

該法是利用鱟試劑檢測(cè)供試品中或其表面可能存在的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的一種方法^[3]。目前，各國(guó)藥典收載的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)法均包含凝膠法。藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是以凝膠法為基礎(chǔ)，通過(guò)試驗(yàn)證明供試品某一濃度對(duì)凝膠法不存在干擾作用后，在供試品的有效濃度范圍內(nèi)，根據(jù)供試品的內(nèi)毒素限值進(jìn)行檢測(cè)的一種方法^[4]。

該法則為各國(guó)藥典中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，可簡(jiǎn)述為取3只健康家兔各注入規(guī)定量的試樣，在一天內(nèi)單兔體溫上升不超過(guò)0.6℃，3兔總升溫不超過(guò)1.4℃，即被認(rèn)為試驗(yàn)中熱原含量合格。

據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，將熱原濃度為5ng/ml的試樣注入家兔體內(nèi)，總量達(dá)到50ng/kg（體重）時(shí)，家兔體溫上升值達(dá)0.6℃。人體感染發(fā)熱的靈敏度是家兔的3倍。如有微量熱原混入藥劑中注入人體血液系統(tǒng)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)熱，甚至引起死亡。因此，盡可能降低藥液中熱原的含量是十分必要的，特別當(dāng)注射液（如大輸液）用量較大時(shí)，對(duì)熱原的濃度要求應(yīng)更為嚴(yán)格。例如上海長(zhǎng)征制藥廠對(duì)大輸液的熱原合格指標(biāo)控制值為0.25EU/ml。

注射用藥液（或注射用水）除熱原，使之符合藥典的檢測(cè)規(guī)定，是醫(yī)藥工業(yè)中的基本生產(chǎn)環(huán)節(jié)。目前，一般介紹除熱原的方法有以下3類：

⑴蒸餾法生產(chǎn)去熱原水，作注射用水、洗滌水等，但其成本較高。

⑵吸附法除熱原。其中方式一是表面吸附劑吸附致熱性物質(zhì)，而讓產(chǎn)品物質(zhì)通過(guò)。方式二是吸附劑吸附產(chǎn)品物質(zhì)，讓熱原流出，再把產(chǎn)品物質(zhì)從吸附劑表面解析回收。用作吸附的物質(zhì)可以是硅泥、活性炭和離子交換樹(shù)脂等。禁止使用石棉作為吸附劑。

⑶膜分離法除熱原作為一種新工藝、新技術(shù)，正在制藥行業(yè)推廣應(yīng)用。

超濾法除熱原是一種物理分離方法，選用何種規(guī)格的超濾膜為宜，首先須了解藥液中e熱原的相對(duì)分子質(zhì)量大小、性質(zhì)以及濃度。

文獻(xiàn)[1]提出，由于脂多糖的終端結(jié)構(gòu)類脂A具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，因此需選用切割相對(duì)分子質(zhì)量小于5000相對(duì)分子質(zhì)量的超濾膜。如果選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1萬(wàn)至20萬(wàn)的超濾膜，除去相對(duì)分子質(zhì)量為幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)的熱原，則應(yīng)再使用熱原吸附劑除去小相對(duì)分子質(zhì)量的熱原，包括相對(duì)分子質(zhì)量約為2000的類脂A。這些不同規(guī)格濾膜的平均孔徑為2nm到0.1μm

稻見(jiàn)良秋等報(bào)道^[5]，用超濾法除熱原，必須采用孔徑為1nm的超濾膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量6000左右。但產(chǎn)量低，處理量大時(shí)，設(shè)備大型，壓力要求也較高。其次，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量規(guī)格為5000或10000的超濾膜除熱原，對(duì)部分含有較大相對(duì)分子質(zhì)量成份的藥液是不合適的。因?yàn)椋�在除去熱原的同時(shí)會(huì)把藥液中的有效成分阻留與吸附，使產(chǎn)品得率大受影響。因此，也有選用10萬(wàn)至30萬(wàn)截留相對(duì)分子質(zhì)量的濾膜除去大部分發(fā)熱性物質(zhì)后（產(chǎn)品物質(zhì)基本上通過(guò)濾膜），再采用熱原吸附劑除去余下部分熱原，使得產(chǎn)品收得率既高，去除熱原效果又好。為了提高產(chǎn)量，采用聚酰胺（尼龍）為原料制成的微孔濾膜，過(guò)濾熱原濃度為20ng/ml的自來(lái)水，由于材質(zhì)具有特異的吸附熱原的特性，過(guò)濾后的水質(zhì)符合藥典規(guī)定，其產(chǎn)量高達(dá)2000L/（m²·h）。

K.Mueeller報(bào)道^[6]，除熱原用超濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量規(guī)格是6000。

永田彥在其專利^[2]中稱，一般的注射液，為除去低相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)熱物質(zhì)，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量1萬(wàn)的超濾膜。

田原修等^[7]采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1萬(wàn)的超濾膜，平板式裝置，除去乳酸鈉中的熱原。

橋本雅文^[8]指出，一般從低相對(duì)分子質(zhì)量藥液中去除熱原采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1萬(wàn)的濾膜，包括靜脈注射液除熱源。

M．M．Solin報(bào)道^[9]，用尼龍66制成的帶電荷微孔濾膜，孔徑大小為0.1、0.2μm和0.45μm，也可用于對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量為4萬(wàn)的葡聚糖溶液除熱原。其中0.45μm的微孔膜作預(yù)處理，0.1μm和0.2μm的微孔膜進(jìn)一步作除熱原處理。

綜上所述，超濾膜孔徑及材質(zhì)的選擇，需視被處理藥物的相對(duì)分子質(zhì)量、特性，及藥品中熱原的含量而定，通過(guò)工藝試驗(yàn)選擇最為合適的超濾膜規(guī)格及處理工藝。

由于超濾膜的活性層很薄，用久了可能會(huì)出現(xiàn)針孔，降低截留率造成熱原和細(xì)菌的泄漏，另外設(shè)備結(jié)構(gòu)上的不合理也可能存在衛(wèi)生死角而影響濾清液的質(zhì)量，若再加上存在類脂A的致熱物質(zhì)，因此超濾除熱原的效果往往達(dá)不到百分之百的清除，表2就文獻(xiàn)報(bào)道中的有關(guān)數(shù)據(jù)予以歸納。

由表2可見(jiàn)，超濾膜對(duì)熱原的去除率較高，變化范圍較寬，高達(dá)99.99%，低為90%以上。究其原因可知，熱原是一類形態(tài)和相對(duì)分子質(zhì)量均不確定的物質(zhì)，熱原的種類、濃度隨藥液而異，因此熱原去除率也是個(gè)多因素決定的量。

用二級(jí)處理工藝，超濾 + 吸附法，使SOD藥液的回收率、產(chǎn)量、重復(fù)性、可靠性和經(jīng)濟(jì)性方面都十分優(yōu)異。

濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為10萬(wàn)，對(duì)牛血清蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量6.7萬(wàn)）的截留率為60～80%，二級(jí)脫熱原吸附劑經(jīng)篩選后確定，對(duì)藥液的化學(xué)組分適當(dāng)調(diào)整，有利于提高收率。超濾膜的再生采用通常的1mol/L的NaOH浸泡處理，吸附劑的再生經(jīng)三步處理。SOD藥液經(jīng)家兔法檢測(cè)，呈陰性。處理結(jié)果列于表3。

 

發(fā)熱性物質(zhì)去除方法	熱原濃度/（ng·ml）-1 處理前       處理后		SOD回收率/%
膜過(guò)濾+去熱原吸附劑處理	約1萬(wàn)	0.01以下	96
膜過(guò)濾	約1萬(wàn)	1～10	98
吸附法（比較例）	約1萬(wàn)	10～100	—

本藥品為治療腦血栓的特效藥，注射治療，藥品中的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約5萬(wàn)。為此而研制了截留相對(duì)分子質(zhì)量規(guī)格為30萬(wàn)的超濾膜，用作一級(jí)超濾處理。二級(jí)處理亦用脫除熱原吸附劑。處理后的主要結(jié)果見(jiàn)表4。

發(fā)熱性物質(zhì)去除方法	內(nèi)毒素濃度/（ng·ml）-1 處理前        處理后		藥液成分收得率 /%
膜過(guò)濾+去熱原吸附劑處理	0.1～１萬(wàn)	0.01	＞90
膜過(guò)濾	0.1～１萬(wàn)	1～10	98
脫熱原吸附柱（比較例）	0.1～１萬(wàn)	10～100	—

由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乳酸鈉粘度高，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量1萬(wàn)的濾膜過(guò)濾時(shí)通量較低。為了提高產(chǎn)量，采取對(duì)設(shè)備、管路夾套加熱的方法，使料液升溫至50～60℃，這個(gè)措施明顯地提高了處理產(chǎn)率，如圖1可見(jiàn)，58℃時(shí)的過(guò)濾速度為40℃時(shí)的2.5倍，而熱原去除率保持在97%以上。溫度超過(guò)60℃后，由于膜孔徑放大，膜的截留率下降，致使除熱原效果明顯下降。所以說(shuō)，超濾法除熱臺(tái)對(duì)不同的藥液均有一個(gè)確定工藝條件的試驗(yàn)過(guò)程.

                  

采用超濾組件 + 離子交換 + 離子交換纖維三級(jí)處理流程，構(gòu)成小型化超純水制備裝置，滿足電子、醫(yī)藥、精密化學(xué)分析等部門(mén)的使用要求。其中離子交換纖維是專利成果。超濾膜的分離孔徑為10nm，內(nèi)徑250μm，膜厚30μm，過(guò)濾面積1.6m²，裝填混合樹(shù)脂MB-2型1.8L，纖維混合體0.2L，流速50L/h，裝置體積45cm×45cm×25cm，質(zhì)量20kg，一次可制純水600L，水質(zhì)指標(biāo)詳見(jiàn)表5..

M．Thomas^[1]經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，建立了“超濾＋吸附法”除熱原新工藝。該工藝中使用的超濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量為1萬(wàn)～20萬(wàn)，膜的平均孔徑為0.002～0.1μm，通常為3～20nm，這種膜具有較大的空隙和較高的通量，可去除相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)萬(wàn)至幾百萬(wàn)的熱原，然后用除熱原吸附劑除去相對(duì)分子質(zhì)量幾萬(wàn)以下的熱原以及相對(duì)分子質(zhì)量大約為2000的類脂A物質(zhì)。該工藝在超濾膜使用較長(zhǎng)時(shí)間截留率降低后，熱原也可以被吸附劑除去，并且相對(duì)分子質(zhì)量為2000的類脂A也能有效去除。該工藝可以使醫(yī)藥的有效成分很容易地透過(guò)膜，從而提高藥品的收得率。

該工藝使用的超濾膜材質(zhì)有聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等，設(shè)備形式可以為中空纖維、卷式、折疊式或板框式等。這些不同形式的設(shè)備各具有特點(diǎn)，其中由卷式超濾組件構(gòu)成的設(shè)備膜面積大，濾膜更換方便，但對(duì)原液的預(yù)處理要求較高。中空纖維超濾組件的濾膜裝填密度高，泵容量小，但不能單獨(dú)換膜，對(duì)原液預(yù)處理要求高。板框式超濾設(shè)備原液預(yù)處理容易，濾膜可單張更換，單設(shè)備體積較大，預(yù)清洗有一定難度。

該工藝采用多種材質(zhì)與型號(hào)的吸附劑。對(duì)原液中的熱原濃度要求低于10⁴ng/ml為宜.

該工藝的應(yīng)用實(shí)例包括制備酶制劑，合成蛋白質(zhì)、肽、荷爾蒙和多糖物質(zhì)的藥類，大輸液如葡聚糖輸液、果糖輸液、葡萄糖輸液等。檸檬酸鈉注射液的生產(chǎn)也可采用本項(xiàng)工藝。

應(yīng)用實(shí)例，人體血清蛋白（HSA）的精制，先用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10萬(wàn)的中空纖維超濾膜組件過(guò)濾，再流經(jīng)裝有吸附劑的吸附柱。HAS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%降至3.2%或3%，熱原則從1300ng/ml分別降至3ng/ml和0.016ng/ml。產(chǎn)品的回收率為60%，超濾熱原的去除率為99.8%，全工藝為99.998%.