一種利用表面等離子共振定量流感病毒的新方法—單向放射免疫擴(kuò)散法

譯自= A novel assay for lnfluenza virus quantification using surfece plasman resanance. Vaccine 2010 Jan8:28(3)759-65

C. Estmer Nilsson 1, S.Abbas1, M.Bennem 1,

A.Lorssan 2, M.D. Hamalalnen 2, A. Frostell Karlssan 2

1 GE Heathcare BioScience AB, Bjorkgatan 30, SE-751 84 Uppsata,Sweden

2 GE Heathcare BioScience AB. Rapsgatan 23. SE-751 84 Uppsata Sweden

 

    利用單向放射免疫擴(kuò)散法(SRID)來定量血細(xì)胞凝集素(HA)，是確保季節(jié)性流感疫苗的產(chǎn)品效力的主要方法。本文介紹了一種利用生物傳感器技術(shù)定量流感病毒的新方法。此方法通過將HlNl、H3N2和B型病毒的HA蛋白固定在傳感器芯片上，以抑制性分析的形式來定量病毒。初步結(jié)粟顯示這種分析與SEID相比，具有具有更高的靈敏度(檢測(cè)范圍0.5—10 ug/ml)和更高的精確度，并且能顯著降低了分析及手工操作時(shí)間。

 

    流感病毒疫苗的接種是降低季節(jié)性流感死亡率的基本策略。在開發(fā)和生產(chǎn)過程中流感疫苗的抗原含量主要是利用免疫化學(xué)法定量血細(xì)胞凝集素(HA)來確定的。單向放射免疫擴(kuò)散法(SRID)其中最常用也是最重要的方法。自1978年以來，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的所有人滅活流感病毒疫苗的效力加的效力都是用SRID來確定的。同時(shí)，它還是世界衛(wèi)生組織(WHO)和歐洲藥品管理局(EMEA)的推薦方法[1-3]。然而，除了非常耗費(fèi)勞力，這種方法還有一些其它缺陷，如準(zhǔn)確性低、精確度和靈敏度也低[4]。

 

    到目前為止，流感疫苗主要是利用雞胚來生產(chǎn)的。然而，對(duì)流感病毒新近爆發(fā)的恐慌讓人們著手利用細(xì)胞門著手利用細(xì)胞培養(yǎng)來更有效地生產(chǎn)疫苗。這種工藝開發(fā)急需新的靈敏而簡(jiǎn)單的分析工具。

 

    目前已有多種不同的針對(duì)流感病毒的定量和檢測(cè)方法見諸報(bào)道：酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)[5-7]。神經(jīng)氨酸酶(NA)活性分析[8,9]，HPLC法[10-12]，血凝分析[11,13]，以及定

量PCR(qPCR)[14-16]。其中一些方法與SRID相比，靈敏度有所提高。然而，除了多重定PCR，這些方法都不能減少手工操作時(shí)間，也不能在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)定量三種不同亞型的HA。然而，鑒于qPCR必須經(jīng)過將RNA轉(zhuǎn)化成DNA的反轉(zhuǎn)錄步驟，因而相比起定量qPCR更適合用于流感病毒及分型上。Williams等[17]展示了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合同位素稀釋，用于病毒蛋白的絕對(duì)定量。此方法的優(yōu)勢(shì)在子能在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析三價(jià)疫苗，而且降低了對(duì)參照抗原和血清的需求量。然而，由于確定HA濃度的獨(dú)立參考標(biāo)準(zhǔn)無法得到，也就無法與SRID測(cè)定進(jìn)行直撞的比較。此外，這個(gè)方法還需要在分析前制備樣品[17]。

 

    過去也有利用表面等離子共振(SPR)來檢測(cè)并定量流感病毒的報(bào)道，這些全是基于直接的結(jié)合方法[18-25]。這些研究要么測(cè)定HA與它的唾液酸受體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)[20,22]，要么測(cè)定抗體與HA和NA的親和力[18,19,21]。或者描述HA的RNA適體（aptamer）篩選[23]。其中一篇報(bào)道介紹了在處理樣品和疫苗中定量流感病毒的方法[25]。這種方法利用唾液酸型化臺(tái)物作為多種病毒株通用的弱親和力配體，分析范圍在10-100 ug/ml。它利用了持續(xù)的弱親和力生物傳感方法來避免了再生的需要，并減少了分析時(shí)間[25]。小型化的生物傳感器也經(jīng)過

    禽流感病毒檢測(cè)的測(cè)試，特定抗原的檢測(cè)極限在5 ug/ml[26]。盡管這些基于SPR的方法縮短了手工操作時(shí)間，但它們并不比SRID更靈敏，也無法同時(shí)分析三種病毒株。

    在此我們介紹一種新方法，利用表面等離子共振以抑制分析的形式準(zhǔn)確定量流感病毒。重組的HA蛋白[27](分別為A/H1N1,A/H3N2和B)固定在傳感器芯片的葡聚糖基質(zhì)上，隨后讓病毒抗原和血滴混合液中針對(duì)三種流感類型特異的游離抗體與表面的HA蛋白結(jié)合，產(chǎn)生響應(yīng)的變化(圖1)。樣品中病毒濃度越高，殘余抗體結(jié)合響應(yīng)就越低。重組HA蛋白固定在同一塊芯片表面的三個(gè)不同流動(dòng)槽內(nèi)，這樣就能在同一實(shí)驗(yàn)中分析三價(jià)疫苗。研究表明生物傳感器分析是可靠的．與SRID相比回收率、精確度和靈敏度更高，而分析時(shí)間更短。校準(zhǔn)曲線范田是0.5-10 ug/ml,所有三種亞型(A/H3N2、AHlNl和B)的檢測(cè)極限預(yù)計(jì)低子0.5 ug/ml。由于此方法中的參照抗原和血清與當(dāng)前疫苗效力檢測(cè)方法中所使用的相同。這種新方法有可能取代或者補(bǔ)充SRID，成為未來的流感疫苗的定量方法。

 

    材料和方法

    對(duì)照血清(綿羊)和病毒抗原購自英國(guó)NIBSC，除了B/Brisbane/3/2007血清和抗原來自荷蘭Solvay Phormaceuticols，PR/B/34血清(雞)和病毒是購自美國(guó)Charles River Laboratories。重組的全長(zhǎng)HA蛋白(A/H1N1/New Caledonia/2O/99、A/H3N2/Wyaming/3/2003和B/Jilin/20/2003)分別購自以色列PraspecBio、荷蘭Genway和美國(guó)Protein Sciences。表4中分析的工藝樣品來自瑞典通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，除了B/Brisbane/3/2007 MBV和TBV)樣品以及A/H1N1/Salamon Islands/3/200 TBV樣品是由荷蘭Solvay Pharmaceuticals提供的。三價(jià)疫苗購自三家制造商。覆面活性劑P2O(polyoxyethglenesorbitan)、HBS-EP+緩沖液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05％表面活性劑P2O)、氨基偶聯(lián)試劑盒、Cy3-染料、瓊脂糖和DNA均來自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。牛血清白蛋白(BSA)購自Pierce，DMEM購自Invitrogen，蔗糖、NaCl和兩性洗滌劑Zwittergent購自默克。

 

    所有分析都使用了Biacore TM l00系統(tǒng)和CMS傳感器芯片(通用電氣醫(yī)療集團(tuán))。相互作用研究是基于金表面的表面等離子共振檢測(cè)，再結(jié)合處理試劑的微流體系統(tǒng)。生物分子之間的相互作用以非標(biāo)記分析形式實(shí)時(shí)監(jiān)控。相互作用分子中的一方固定在傳感器表面的半流體葡聚糖基質(zhì)上。另一個(gè)分子隨后注入到流經(jīng)傳感器表面的溶液中。當(dāng)注入樣品中的分子與固定在傳感器表面的相互作用配體結(jié)合時(shí)，即可檢測(cè)到SPR響應(yīng)的變化。響應(yīng)水平的變化與表面上質(zhì)量的變化成正比。此方法設(shè)定為抑制分析(圖1)，以避免大的病毒分子的擴(kuò)散影響[28]。樣品無需預(yù)處理就能分析。HBS-EP+作為分析緩沖液。采用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)步驟[29]，注入50-80 ul重組HA(10 ug/ml)從而將重組HA蛋白固定在7000-10000個(gè)響應(yīng)單位(RU)，條件分別為l0 mM馬來酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 6.5)(HA/H1Nl l5分鐘,HA/H3N2 7分鐘),或者在10 mM磷酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 7.0)。(HA/B 20分鐘)。

 

    對(duì)抗流感血清進(jìn)行滴定，以在400s注射時(shí)間內(nèi)在各自對(duì)應(yīng)的表面上產(chǎn)生700-l400個(gè)RU的響應(yīng)。將病毒參照抗原混合物，或未知濃度的病度樣品，與固定稀釋度的抗流感血清混合，在400s內(nèi)注入表面。隨后利用50 mM HCl、或者0.05％Surfactant P2O再生表面(30s)。注射樣品中的游離抗體與表面的HA結(jié)合。產(chǎn)生響應(yīng)(圖1)。每次分析時(shí)先進(jìn)行5-10次只有血清和再生步驟的啟動(dòng)循環(huán)，以穩(wěn)定表面。在每次分析開始、中間和結(jié)束時(shí)均分析血清和參照抗原的校準(zhǔn)曲線。為了在分析過程中根據(jù)校準(zhǔn)曲線的改變而調(diào)整，將三個(gè)校準(zhǔn)曲線中的四個(gè)參數(shù)回歸的換算系數(shù)用于生物傳感器軟件的原型功能性的標(biāo)準(zhǔn)化。因此每個(gè)樣品得到一組獨(dú)特的校準(zhǔn)曲線系數(shù)，用于樣品濃度的計(jì)算。

 

    在微滴定板中制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，樣品體積40-80 ul，分析一股以無人值守的模式過夜運(yùn)行(96個(gè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品約15個(gè)小時(shí))。

    可靠性測(cè)試所使用的添加劑為DNA、BSA、DMEM、蔗糖和NaCl，如表3所示。

    在三價(jià)分析中，HAA/H1Nl、A/H3N2和B固定在同一塊芯片的三個(gè)不同通道中(圖7)。首先將三個(gè)特定的參照抗原與血清(A/H1N1/Solomo Islands、A/H3N2/Wiscansin、B/Malaysia)混合，以形成三價(jià)的校準(zhǔn)曲線抗原和三價(jià)血清。樣品隨后穿過三個(gè)表面，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)分析三個(gè)毒株。

按照制造商所提供的SRID滴度按比例稀釋血清亞型特異性研究，以評(píng)估血清親和力的差異。

 

 

表1 計(jì)算濃度和變異系數(shù)，以分析B/jiangsu/10/2005(圖3)

   

    血清以Cy3-染料標(biāo)記。未標(biāo)記的血清和Cy3-標(biāo)記的血清（小于總血清量的0.5％；證實(shí)不會(huì)干擾沉淀)與熔化的瓊脂糖混合，澆鑄在模中，以形成凝膠中的孔。樣品和參照抗原在加入凝膠孔之前，用1％的兩性洗滌劑Zwittergent在-22處理30分鐘。凝膠在-22 15-18個(gè)小時(shí)，隨后干燥，并在Typhoon的450nm下掃尾。利用ImageQuant TL軟件將樣品的環(huán)狀區(qū)與參照抗原比較，從而進(jìn)行評(píng)估。儀器和軟件皆來自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。

 

    圖2分別顯示了三個(gè)分析(B、H3N2和HlNl)的典型校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線的動(dòng)態(tài)范圍優(yōu)化到0.5-10 ug/ml產(chǎn)生的回收率在98-102%。根據(jù)參照抗原的連續(xù)稀釋(低至0 ug/ml)，所有三種亞型的檢測(cè)極限預(yù)計(jì)低于0.5 ug/ml，定量極限約1ug/ml。圖1顯示了在重組HA表面上重復(fù)注射不同濃度（0.5-16 ug/ml)的B/Jiongsu/10/2005血清和抗原后的相對(duì)響應(yīng)。計(jì)算出的濃度顯示在表1。

 

    曾提到響應(yīng)會(huì)隨時(shí)間而降低，這在最初10-20個(gè)循環(huán)中最大，之后隨循環(huán)數(shù)增加而穩(wěn)定。所有待測(cè)的參照抗原在個(gè)自的表面也檢測(cè)到類似的結(jié)果，改變?cè)偕鷹l件或者用去污劑預(yù)處理樣品也不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)。為了增加分析的準(zhǔn)確性，運(yùn)行了三個(gè)校準(zhǔn)曲線，樣品濃度是由差值校準(zhǔn)曲線來確定的，如第2部分所示。

 

    為了研究針對(duì)不同毒株的血清與表面上重組HA蛋白之間相互作用的特異性，在所有三個(gè)表面上分析了不同毒株的抗血清(圖4)。血清在參照抗原(2 ug/ml)和無參照抗原下進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)反應(yīng)是相應(yīng)病毒所特異的，以及病毒本身不會(huì)產(chǎn)生非特異的背景影響。結(jié)果表明固定在表面的三種重組HA蛋白分別是三類亞型A/H1N1、A/H3N2和B血清所特異的，而對(duì)于同亞型病毒內(nèi)的毒株之間則是通用的。所有血清中只有一種能與所有表面結(jié)合(雞/H1N1/PR/8/34血清，數(shù)據(jù)末顯示)。其中的原因目前未知�？赡苁请u來源的成分引起了非特異響應(yīng)，而其它血清都來自綿羊。

 

    為了擴(kuò)展特異性研究，對(duì)27種不同的血清與固定了HA/H3N2的表面之間的結(jié)合進(jìn)行分析(圖5、表2)。結(jié)果顯示只有特異針對(duì)H3N2亞型的血清才能與表面明顯結(jié)合�？�-B和抗-H1N1血清顯示出低的結(jié)合水平。相應(yīng)地，利用50 mM HCl、0.05％ P2O再生后，也開展了27種血清與固定了HA/B和HA/H1N1的表面結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示只有抗-B和抗-H1Nl血清分別明顯結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。

 

 

 

    圖5 27種不同血清(表2中詳細(xì)說明)在固定了重組HA/H3N2的傳感器芯片上的響應(yīng)。A/H3N2血清毒株的結(jié)合以實(shí)心菱形標(biāo)出，A/H1N1血清毒株以空心菱形標(biāo)出，B毒株以空心正方形標(biāo)出。用50 mM HCl和0.05％ P2O再生表面。血清1和2重復(fù)分析兩次，以監(jiān)測(cè)響應(yīng)偏差。

    開展初步分析以探索毒株特異性。在固定了重組HAA/H3N2/Wyoming的傳感器芯片上運(yùn)行校準(zhǔn)曲線，該曲線有著標(biāo)準(zhǔn)品和血清的四個(gè)可能組合，針對(duì)隨機(jī)選擇的H3N2毒株Wyoming和New York(圖6A)。最低濃度的響應(yīng)水平范圍在1700-2000個(gè)RU。為了利于比較，將各個(gè)曲線的每個(gè)響應(yīng)除以最低濃度(以％表示)，來標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)。曲線以N.Y/N.Y、N.Y/W、W/W和W/N.Y的順序運(yùn)行。W/W組合在另一塊有著相似固定水平的芯片上重復(fù)運(yùn)行4次，提供實(shí)驗(yàn)差異的參考數(shù)據(jù)(圖6B)。結(jié)果顯示所有W/W組合的抑制實(shí)現(xiàn)了最高的靈敏度。結(jié)果還表明，就這兩個(gè)毒株而言，如果用New York標(biāo)準(zhǔn)品和血清來定量Wyoming樣品，合獲得過高的計(jì)算濃度值。

 

    在疫苗純化過程中，各個(gè)步驟的樣品有著不同的純化圖，可能會(huì)含有影響濃度分析的化合物。為了研究分析中添加劑的影響，分析前在參照抗原中加入了BSA、-DNA、細(xì)胞培養(yǎng)基、蔗糖和鹽。結(jié)祟顯示在表3。BSA、-DNA和細(xì)胞培養(yǎng)基不影響分析。鹽和蔗糖降低了響應(yīng)，顯著增加了表觀濃度：然而這些添加劑的影響可用稀釋處理來避免。研究發(fā)現(xiàn)1<％的蔗糖和<0.2 M的NaCl對(duì)于可靠定量是理想的。還重復(fù)運(yùn)行了含有55 ug/ml純化的A/H1N1/Solomon slond的對(duì)照樣品，以研究準(zhǔn)確性。在一個(gè)分析(一塊芯片/凝膠)內(nèi)，生物傳感器方法的內(nèi)部CV為2％(5次重復(fù))，而SRID為9％(12次重復(fù))。兩個(gè)操作員在不同時(shí)間所做的不同分析之間，生物傳感器方法的內(nèi)部CV為5％(3次分析)，而SRID為18％(5次分析)。

 

    為了測(cè)試生物傳感器方法的性能，對(duì)流感疫苗純化過程中不同階段的樣品進(jìn)行了分析，從收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清到過濾終產(chǎn)物。同一個(gè)樣品還用SRID分析以進(jìn)行比較。結(jié)果匯總見表4。樣品經(jīng)過稀釋，這樣一般每個(gè)樣品的兩次稀釋能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的濃度。每個(gè)樣品重復(fù)兩次，并計(jì)算出每次稀釋的變異系數(shù)(CV)。對(duì)于大部分樣品，兩種方法的結(jié)果有著良好的一致性，但生物傳感器測(cè)定與SRID相比，兩次重復(fù)之間的CV要低得多且靈敏度更高。對(duì)于少數(shù)HA濃度高(>100 ug/ml)的樣品，線性稀釋很難實(shí)現(xiàn)。不過，這是生物傳感器和SRID兩種方法都有的，因此可認(rèn)為源于樣品，而不是稀釋本身。

 

 

    Biocore T100可將樣品連續(xù)注射在四個(gè)流動(dòng)槽中，每個(gè)流動(dòng)槽有著獨(dú)立的傳感器表面。為了在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析三價(jià)疫苗，三個(gè)流動(dòng)槽的傳感器表面分別固定了HAA/H1Nl、A/H3N2和B。利用參照抗原和特異抗血清的三價(jià)混合物對(duì)來自三家制造商的疫苗進(jìn)行分析(圖7)。疫苗同時(shí)用SRID分析(在三塊不同的凝膠上)。SRID和生物傳感器方法的測(cè)定仍然很相似，且生物傳感器方法的重復(fù)實(shí)驗(yàn)精確度更高。生物傳感器方法的總分析時(shí)間為9小時(shí)，手工操作為1-2小時(shí)。而SRID分析的總時(shí)間為22個(gè)小時(shí)，手工操作為6-8小時(shí)。

 

 

 

 

 

 

    在本文中，我們展示了一種新穎的定量HA的生物傳感器方法的開發(fā)和初步結(jié)果，它利用了與SRID方法相同的參照抗原和血清，再加上固定的HA。

 

    來自不同供應(yīng)商的重組HA蛋白經(jīng)過固定化的測(cè)試，并根據(jù)固定性質(zhì)(如活性和直接稀釋到固定緩沖液的高濃度)進(jìn)行挑選(數(shù)據(jù)未顯示)。挑選出的蛋白可利用標(biāo)準(zhǔn)的氨基偶聯(lián)步驟，在接近中性(pH 6.5-7.0)的緩沖液中輕松地進(jìn)行固定化。其它蛋白固定化試劑，如通過活性二硫化物[29]或蛋白上引入的醛基來偶聯(lián)，也能產(chǎn)生活性表面，只是隨時(shí)間的穩(wěn)定性比胺偶聯(lián)方法所獲得的稍遜(數(shù)據(jù)未顯示)。除了利用表面上的重組HA，初步研究顯示單價(jià)疫苗(MBV)，特別是亞基或裂解疫苗，也可以固定并得到相似的定量結(jié)果(數(shù)據(jù)在別處顯示)。MBV可能成為表面物質(zhì)的更可靠來源，因?yàn)橐呙缰圃焐虝?huì)在年度生產(chǎn)中確保其供應(yīng)量。

 

    用較早期的血清來獲得初步定量的可能性。亞型特異性分析結(jié)果以及定量的高度準(zhǔn)確性(或許這更為重要)  (圖3，表1和4)表明再生不會(huì)分析性能產(chǎn)生負(fù)面影響。利用這種再生，經(jīng)歷>100次樣品/標(biāo)準(zhǔn)品處理也依然可以保持其對(duì)所有三種亞型足夠的結(jié)合活性從而進(jìn)行可靠地定量。表面活性劑P2O(Tween 20)包含在所有溶液中，因?yàn)橐阎�它能在不影響相互作用分析的前提下防止蛋白吸附在流�?dòng)系統(tǒng)中，從而使原始樣品得以進(jìn)行分析。而且，研究表明非離子型去污劑的添加有助于防止HA聚集[33]。針對(duì)H3N2利用兩個(gè)隨機(jī)選擇的毒株(New York和Wyoming)來簡(jiǎn)單研究其毒株特異性。正如由遺傳差異所得預(yù)期，兩種血清和參照抗原對(duì)另一毒株表現(xiàn)出不同的結(jié)合模式(圖6)。當(dāng)抗原和血清都是Wyoming時(shí)，此組合所獲得的靈敏度最高。這反映出這些試劑比NewYork試劑具更高的親和，從而導(dǎo)致對(duì)表面結(jié)合產(chǎn)生更有效的抑制，而不是因?yàn)楣潭ǖ腍A是Wyoming。采用與分析樣品毒株不同的參照抗原和血清，可獲得不同的絕對(duì)濃度。不過，工藝開發(fā)中產(chǎn)量的比較并不一定需要絕對(duì)濃度。可以通過進(jìn)一步研究來探索毒株間的遺傳相近性所決定的這種差異的相關(guān)性。蔗糖(>1％)和氯化鈉(>0.2 M)在可靠性測(cè)試中確實(shí)干擾了所測(cè)量到的響應(yīng)。蔗糖和鹽濃度升高，響應(yīng)降低(使HA濃度計(jì)算值增加)。已知在超出生理?xiàng)l件下鹽濃度的增加會(huì)削弱抗體與抗原的結(jié)合。在疫苗純化過程中，常使用蔗糖梯度和層析柱，獲得蔗糖>40%、NaCl>0.5 M的樣品，然而由于這些樣品中的病毒濃度也很高(>200 ug/ml)，因此可通過稀釋過程來避免這種附加效應(yīng)。季節(jié)性流感疫苗應(yīng)當(dāng)富有三種不同的流感病毒株(H1N1、A/H3H2和B)的每種各15 ug的血細(xì)胞凝集素。為了用SRID方法來分析三價(jià)季節(jié)性流感疫苗半成品和最終產(chǎn)品，疫苗制造商必須進(jìn)行三次單獨(dú)的分析。有了生物傳感器方法，就能夠在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中定量疫苗中的三種不同毒株(圖7)，讓三價(jià)疫苗的批次放行更加有效。此外，與SRID相比，生物傳感器方法顯示出更高的回收率和測(cè)量精確度。精確度更高，將有可能減免過高疫苗劑量的需要。

 

    綜上所述，本文展示的初期數(shù)據(jù)表明，與SRID相比，生物傳感器方法具有高準(zhǔn)確性及更高的靈敏度和精確度，同時(shí)可顯著減少的分析和手工操作時(shí)間。將這種方法擴(kuò)展到固定化亞基、裂解甚至整個(gè)病毒疫苗的形式，將會(huì)開創(chuàng)定量方法的更廣泛應(yīng)用，包括表位定位和動(dòng)力學(xué)分析等基礎(chǔ)研究。