細(xì)胞破碎技術(shù)
細(xì)胞破碎技術(shù)
細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。
細(xì)胞破碎阻力
細(xì)菌
幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。短肽一般由四或五個(gè)氨基酸組成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-賴氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。
酵母菌
酵母細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。
真菌
霉菌的細(xì)胞壁主要存在三種聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷鍵連接，某些以β-1,6糖苷鍵連接），幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白。最外層是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第3層主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。
植物細(xì)胞
對(duì)于已生長結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 初生壁是細(xì)胞生長期形成的。 次生壁是細(xì)胞停止生長后，在初生壁內(nèi)部形成的結(jié)構(gòu)。 目前，較流行的初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由Lampert等人提出的“經(jīng)緯”模型，依據(jù)這一模型，纖維素的微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向一層一層敷著在上面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同，互成一定角度，形成獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的“經(jīng)”，模型中的“緯”是結(jié)構(gòu)蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細(xì)胞質(zhì)分泌，垂直于細(xì)胞壁平面排列，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。半纖維素和果膠等膠體則填充在網(wǎng)絡(luò)之中，從而使整個(gè)細(xì)胞壁既具有剛性又具有彈性。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。
細(xì)胞破碎技術(shù)
目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。 破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。
機(jī)械法
～高壓勻漿破碎法（homogenization） 高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。
～振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead) 將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積, 用6500RPM振蕩機(jī)高速上下振動(dòng)8秒,休息8秒,再振動(dòng)8秒即可.此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法. 一臺(tái)機(jī)器最多可以在一天處理2400支樣品.對(duì)小量且多樣的人很方便.
～高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī) 。
～超聲波破碎法（ultrasonication） 超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。
非機(jī)械法
～滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock） 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。
～凍融破碎法（freezing and thawing） 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。
～酶溶破碎法（enzyme lysis） 酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陽性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。
～化學(xué)破碎法（chemical treatment） 采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑
～去垢劑破碎法（detergents）
蛋白質(zhì)復(fù)性
利用包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。
