內(nèi)源性FSTL1 通過(guò)激活鈉-鉀泵引起的膜超極化調(diào)節(jié)痛覺(jué)信息傳遞

 

    突觸是神經(jīng)細(xì)胞間信息傳遞的關(guān)鍵部位，信號(hào)從一個(gè)神經(jīng)元傳遞到另一個(gè)神經(jīng)元需要通過(guò)突觸這一“關(guān)卡”。神經(jīng)元的膜電位和興奮性對(duì)于調(diào)節(jié)其功能起十分重要的作用。神經(jīng)元消耗能量，通過(guò)鈉‐鉀泵（Na+, K+‐ATPase，NKA）在細(xì)胞漿中濃集鉀離子并排出細(xì)胞內(nèi)的鈉離子，從而維持細(xì)胞膜內(nèi)外的鈉、鉀離子濃度梯度，調(diào)控神經(jīng)元的膜電位和興奮性。既往研究證實(shí) ATP、鈉和鉀離子可以調(diào)節(jié)鈉‐鉀泵的功能以及一些神經(jīng)遞質(zhì)、激素通過(guò)它們的受體間接地調(diào)節(jié)鈉‐鉀泵活性，還發(fā)現(xiàn)哇巴因（ouabain）以及地高辛可以直接抑制鈉‐鉀泵活性；然而，人體內(nèi)是否存在鈉‐鉀泵的內(nèi)源性的激動(dòng)劑還不清楚。

 

    近日，中科院上海生科院神經(jīng)所張旭實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）的研究，發(fā)現(xiàn)在 DRG 中有一種選擇性高表達(dá)的蛋白——濾泡素抑制素樣蛋白1（Follistatin‐like 1，F(xiàn)STL1）能通過(guò)清亮小泡運(yùn)輸至脊髓內(nèi)的傳入神經(jīng)末端釋放，并直接與傳入神經(jīng)末端突觸前膜上的鈉‐鉀泵 α1 亞基相結(jié)合，增強(qiáng)鈉‐鉀泵活性，使細(xì)胞膜超極化，從而對(duì)傳入神經(jīng)末端的興奮性突觸傳遞起抑制作用。這一研究發(fā)現(xiàn)了FSTL1 作為第一個(gè)被人們認(rèn)識(shí)到的內(nèi)源性鈉‐鉀泵激動(dòng)劑在調(diào)控突觸傳遞方面的重要作用。

 

FSTL1‐鈉鉀泵系統(tǒng)調(diào)節(jié)突觸傳遞的模式圖：膜去極化導(dǎo)致突觸囊泡和FSTL1 囊泡釋放，釋放的FSTL1 激活傳入神經(jīng)末端突觸前膜上的鈉鉀泵的1亞基，使細(xì)胞膜超極化，從而對(duì)傳入神經(jīng)末端的興奮性突觸傳遞起抑制性作用。

    該研究 DNA 微陣列實(shí)驗(yàn)由生物芯片上海國(guó)家工程研究中心合作完成。

 

    研究者以背根神經(jīng)節(jié)（DRG）為研究對(duì)象。為了尋找在DRG中發(fā)揮特異功能的分子，研究者利用兩大數(shù)據(jù)庫(kù)（Mouse GeneAtlas database和NCBI）找到了71個(gè)可能在DRG中高表達(dá)但是在其他組織中低表達(dá)的基因。與生物芯片上海國(guó)家工程研究中心合作自制點(diǎn)樣芯片，檢測(cè)這71種基因在不同組織中的表達(dá)豐度。芯片結(jié)果顯示FSTL1是DRG表達(dá)豐度最高的分子之一。隨后，研究者用Northern blottingh和Western blotting的方法分別檢測(cè)FSTL1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。FSTL1 在DRG表達(dá)量較高，但在別的組織表達(dá)量較低。 對(duì)脊髓背角進(jìn)行蔗糖密度梯度離心實(shí)驗(yàn)，取相同體積的不同比重組份做Western blotting，結(jié)果顯示FSTL1 主要存在于清亮小泡中。體外培養(yǎng)大鼠 DRG 神經(jīng)元檢測(cè)培養(yǎng)基中FSTL1的含量，結(jié)果顯示在沒(méi)有刺激的情況下，F(xiàn)STL1 能緩慢自發(fā)釋放，而K+離子誘導(dǎo)的去極化也能導(dǎo)致 FSTL1 的釋放。而“whole-cell recording”實(shí)驗(yàn)，純化的FSTL1重組蛋白作用于脊髓背角，會(huì)導(dǎo)致興奮性突觸傳導(dǎo)功能的降低。 

芯片結(jié)果顯示FSTL1是DRG 表達(dá)豐度最高的分子之一。

 

綜上所述，研究者發(fā)現(xiàn) FSTL1 是一種在 DRG 高表達(dá)，但是在別的組織低表達(dá)的蛋白；主要存在于清亮小泡，并且通過(guò)清亮小泡傳輸；能自發(fā)釋放或者通過(guò)刺激依賴的方式釋放；釋放后能抑制興奮性突觸傳導(dǎo)。 

 

隨后研究者開(kāi)始尋找 FSTL1 發(fā)揮作用的機(jī)制， 用帶有 Myc 標(biāo)簽的重組 FSTL1蛋白孵育培養(yǎng)的大鼠DRG 神經(jīng)元，BS3交聯(lián)與細(xì)胞膜上受體結(jié)合的 FSTL1，裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解物做Western blotting，用抗Myc 的抗體進(jìn)行免疫共沉淀（IP），在 140 kD 處發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性條帶。由于FSTL1 約 40  kD，因此推斷 FSTL1 結(jié)合了約100  kD的蛋白。相同的方法富集交聯(lián)復(fù)合物，用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白可能為 NKA 的 α1 亞基。放免實(shí)驗(yàn)和 co-IP 實(shí)驗(yàn)證明了與 FSTL1 結(jié)合的蛋白正是 NKA的 α1 亞基。

 

由于 FSTL1 能通過(guò)清亮小泡分泌到胞外，NKA是一種跨膜蛋白。因此推斷，F(xiàn)STL1 可能是與 NKA的胞外部分結(jié)合。研究者合成了 NKA α1 亞基在胞外的肽段， 用 BIAcore 分析這些肽段與 FSTL1 的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn) M3M4 和M7M8 肽段與 FSTL1 的結(jié)合能力較強(qiáng)。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) M3M4 和M7M8部位有突變的α1亞基與FSTL1結(jié)合能力較弱，從另一個(gè)側(cè)面證明了以下結(jié)論：FSTL1 正是通過(guò)與 M3M4和 M7M8 胞外肽段與 NKA α1 亞基結(jié)合。 

 

而在培養(yǎng)的 DRG 神經(jīng)元中加入 FSTL1 重組蛋白能觀察到 NKA 活性的增加，說(shuō)明 FSTL1 的分泌能激活 NKA。NKA活性的增加會(huì)導(dǎo)致傳入神經(jīng)末端的超極化，從而抑制傳入神經(jīng)末端的興奮性突觸傳遞。

課題組與南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所合作，還從動(dòng)物水平上對(duì)上述現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。制備了當(dāng)時(shí)國(guó)內(nèi)第一例條件式敲除小鼠，在DRG中特異性敲除了FSTL1 的基因。研究發(fā)現(xiàn) FSTL1 條件式敲除小鼠興奮性突觸傳遞增強(qiáng)，痛覺(jué)敏感性增加。因此，F(xiàn)STL1 作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性鈉‐鉀泵激動(dòng)劑， 對(duì)于保持正常的軀體感覺(jué)是必需的， FSTL1 減少則會(huì)導(dǎo)致痛覺(jué)感受異常。該發(fā)現(xiàn)表明內(nèi)源性鈉‐鉀泵激動(dòng)劑可以通過(guò)影響突觸傳遞，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能有重要的調(diào)控作用。 

 

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