瘦肉精檢測(cè)高效液相色譜法（鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法）

一、如何檢測(cè)瘦肉精？

    目前，檢測(cè)瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)和免疫分析技術(shù)(IA)。而我國(guó)結(jié)合自己的實(shí)際情況，2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種：即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)。其中將HPLC法作為檢測(cè)瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測(cè)限為0.05μg/ kg，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高，而且假陽(yáng)性率低；缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需貴重儀器、難于操作、價(jià)格昂貴。而GC-MS法優(yōu)點(diǎn)是能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析。GC-MS法與HPLC法相比，檢測(cè)靈敏度更高，假陽(yáng)性率更低，已將GC-MS法定為檢測(cè)瘦肉精的確證性方法。GC-MS法的缺點(diǎn)同HPLC相似。

    目前，英國(guó)的Randox Laboratories litd和德國(guó)的R-biopharm公司均開(kāi)發(fā)出了檢測(cè)肉品、飼料中瘦肉精的ELISA試劑盒。

二、瘦肉精檢測(cè)所需試劑和試紙

　　(1)試劑和材料  以下所有試劑，除特別注明外，均為分析純?cè)噭�；水為符合GB／T6682規(guī)定的二級(jí)水。
    ①鹽酸克倫特羅對(duì)照品：含鹽酸克倫特羅不得少于98．5％
    ②鹽酸
    ③無(wú)水甲醇
    ④氫氧化鈉
    ⑤磷酸二氫鉀
    ⑥磷酸
    ⑦鹽酸溶液  取鹽酸4．2ml，加水至1000ml，即得。
    ⑧o．5mol／L磷酸二氫鉀溶液  取磷酸二氫鉀68g，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．O，用水稀釋至1000ml，即得。
    ⑨0．05mol幾磷酸二氫鉀溶液  取磷酸二氫鉀6．88，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．0，用水稀釋至1000mi，即得。
    a．氫氧化鈉溶液  取氫氧化鈉48，加水使溶解成100mi，即得。
    b．鹽酸克倫特羅對(duì)照品儲(chǔ)備液(1mg／mi)  準(zhǔn)確稱(chēng)取28．3mg鹽酸克倫特羅對(duì)照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。
    ⑩鹽酸克倫特羅對(duì)照品工作液(10ttg／mi)  取lmg／mi儲(chǔ)備液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1個(gè)月。
    ⑾鹽酸克倫特羅對(duì)照溶液(100ng／m1)  取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1個(gè)月。
    ⑿鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒(2～8~C冰箱中保存)
    ⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

    (2)儀器和設(shè)備

STI500高效液相色譜儀

VI2010智能色譜軟件

UV501可變光紫外檢測(cè)器

安捷倫1100二極管陣列檢測(cè)器

8725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、VI-11手動(dòng)進(jìn)樣閥

VertexC18 4.6*250,5um高性能液相色譜柱
    ①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀
    ②分析天平  精度0．00001g
    ③天平  精度0．01g
    ④冷凍離心機(jī)
    ⑤50mi具塞離心管
    ⑥勻漿機(jī)
    ⑦微型振蕩器
    ⑧回旋振蕩器
    ⑨微量移液器  單道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，
    ⑩干熱濃縮器
    ①空氣壓縮機(jī)

    (3)測(cè)定步驟
    ①試料的制備(尿)
    取供試尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為供試試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    取空白尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為空白試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    取空白尿2ml，于3000r／min離心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克倫特羅對(duì)照溶液20／H。作為2ug/l空白添加試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    ②試料的制備(肝)
    取約l00g新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機(jī)以10000r／rain勻漿1-2min，使均勻呈糊狀，一20~C以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?BR>    取均漿后的供試肝樣，作為供試試料。
    取均漿后的空白肝樣，作為空白試料。
    取均漿后的空白肝樣(1土0．05)e添加l00ng／m1的克倫特羅對(duì)照溶液20tzL作為2ng／g空白添加試料。
    a：提取(肝)  取(1士o．05)z試料，置50ml離心管中；加鹽酸溶液5.0mi，旋渦混勻，中速振蕩1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度離心15min；上清液移人另一50ml離心管中，加入氫氧化鈉溶液300gL，混勻，振蕩15min；加0.5mol／l磷酸二氫鉀溶液4。0ml，混勻，2—8~C放置過(guò)夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度離心15min，上清液備用。
    b．凈化(肝)  C，，固相萃取柱依次用無(wú)水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2mi預(yù)洗，不使柱床干涸；將備用上清液全部過(guò)柱；用0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗，擠干，棄去所有淋洗液；用無(wú)水甲醇2mi洗脫，流速控制在0.5ml／mm以下，擠干，收集洗脫液；于50～60~C下用氮?dú)饣蚩諝饩従彺蹈上疵撘海粴堄辔镉盟?.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度離心15rain，清液作為試樣溶液供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    ③測(cè)定
    a．室溫應(yīng)控制在19～30~C。
    b．取在19—30~C放置1—2h的試劑盒，按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計(jì)算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量，插入框架。每個(gè)微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL，封口膜封板，室溫孵育30min。
    c倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒(méi)有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯(lián)板的微?L內(nèi)，稍后倒出孔內(nèi)液體，再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，如此重復(fù)操作洗板3次。
    d．分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL，分別放入不同微孔底中央，并在每孔內(nèi)加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結(jié)合物100~I。，在微型振蕩器上混勻，用封口膜封好，室溫孵育30min。
    e．倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒(méi)有殘余液體，重復(fù)洗板3次。
    f．用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL，室溫避光孵育15min。
    g．用多道移液器每孔加終止液100uL。
    h．在1h內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi)，于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

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    (4)計(jì)算  用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出試料中克倫特羅的含量。

    (5)靈敏度和回收率
    本方法的平均檢測(cè)下限為0.1mg／Kg。
    本方法在1ug／kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60％一120％，豬肝回收率范圍為40％～120％。