反相高效液相色譜法測定三越麻黃顆粒中甘草酸的含量

【摘要】目的建立三越麻黃顆粒中甘草酸的反相高效液相色譜(RP�睭PLC)含量測定方法。方法采用反相高效液相色譜法測定三越麻黃顆粒中甘草酸含量，KromasilODS��1C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm），流動相為乙腈��0.05M磷酸二氫鉀（用三乙胺調(diào)pH5.75）（26.5∶73.5），檢測波長為250，柱溫為40℃，流速為1.0ml/min。結(jié)果三越麻黃顆粒顆粒中甘草酸的線性范圍為3.75～154.5μg/ml(r＝0.9998)，加樣回收率100.2%，RSD=2.5%。結(jié)論采用RP-HPLC法測定甘草酸具有簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點，可為三越麻黃顆粒的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)。

　　【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法甘草酸三越麻黃顆粒

　　三越麻黃顆粒由10味藥材(麻黃、石膏、苦杏仁、板藍(lán)根、甘草、陳皮、柴胡、射干、魚腥草、浙貝母)精制而成。方中甘草為使藥。甘草酸是甘草藥材中的主要指標(biāo)成分之一，擬定該成分的含量測定標(biāo)準(zhǔn)可以反映和控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。建立了HPLC法測定本品中甘草酸的含量，以期達(dá)到能夠準(zhǔn)確定量的目的。

　　1、儀器與試藥

　　1.1儀器Waters2690高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，KromasilODS��1C18色譜柱（5μm,4.6mm×250mm）及保護柱，電子分析天平（BS110S，北京賽多利斯有限公司）。

　　1.2試藥乙腈為色譜純（一級），水為重蒸水，其它試劑均為分析純

　　1.3對照品甘草酸單銨鹽（AldrichChemCo.，批號23,224��6），使用前置于干燥器中干燥至恒重。

　　2、方法

　　2.1色譜條件流動相為乙腈��0.05M磷酸二氫鉀（用三乙胺調(diào)pH5.75）（26.5∶73.5）；檢測波長250nm；柱溫40℃；流速1.0ml/min。

　　2.2溶液的配制

　　2.2.1對照品溶液的制備取甘草酸單銨鹽對照品約20mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用甲醇稀釋成每毫升含3.75，7.49，11.59，14.68，18.62，22.40，26.27，30.13，38.63，74.93，154.40μg甘草酸單銨鹽對照品溶液。

　　2.2.2供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，精密稱取約1.0000g，至50ml量瓶中，加甲醇約30ml，超聲30min，放冷至室溫，定容至刻度，吸取約2ml過0.45μm濾膜，即得供試品溶液。

　　3、結(jié)果

　　3.1系統(tǒng)適用性實驗取“2.2.1”項下標(biāo)準(zhǔn)品溶液、“2.2.2”項下供試品溶液，照“2.1”項下的色譜條件分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。在上述條件下，橙皮苷和供試品中其它組分色譜峰可達(dá)基線分離，甘草酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，以甘草酸峰計算柱效，其理論板數(shù)（N）為6000以上，拖尾因子T為1.04，同時取陰性對照溶液進樣。結(jié)果表明，陰性對照在甘草酸色譜峰位置處無相應(yīng)峰出現(xiàn)。故在系統(tǒng)適用性試驗中規(guī)定理論板數(shù)不得低于6000。供試品和陰性對照的HPLC色譜見圖2～3。

　　3.2線性范圍的考察精密量取甘草酸單銨鹽對照品系列溶液10μl進樣，記錄色譜圖，測定其峰面積。結(jié)果見表1。并以峰面積值（A）對濃度（C）進行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝5834.7C-8388.1,r＝0.9998。以上結(jié)果表明，在3.75～154.5μg/ml范圍內(nèi)，甘草酸峰面積值（A）與濃度（C）有良好的線性關(guān)系。

　　3.3精密度實驗精密吸取上述對照品溶液，重復(fù)進樣5次，甘草酸峰面積值的RSD為0.28％。結(jié)果見表2。

　　3.4穩(wěn)定性實驗取供試品試液（批號20020729）分別于0，2，4，6，8，10h，進樣測定。結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，供試品液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

　　3.5重復(fù)性實驗按擬定的含量測定方法，對同一批供試品(20020915)，分別制備6份供試品溶液，測得峰面積并計算甘草酸含量。

　　3.6回收率實驗取已知含量的供試品9份（批號20020825），分別加入0.7725mg/ml的甘草酸對照品溶液0.46，0.58，0.7ml，按上述供試品制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試品溶液并注入液相色譜儀，計算回收率。

　　3.7供試品測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液適量，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表6。

　　4、討論

　　預(yù)實驗采用《中國藥典》中甘草項下的HPLC條件進行測定，結(jié)果無法實現(xiàn)復(fù)方制劑中甘草酸的有效分離，在采用文獻(xiàn)的條件進行預(yù)試時發(fā)現(xiàn)有可能實現(xiàn)預(yù)期的色譜峰分離，因此以該流動相系統(tǒng)為基礎(chǔ)進行進一步的比例優(yōu)化，結(jié)果表明在提高流動相酸性的同時引入一定量的三乙胺不僅可以提高分離效果，也可以起到保護色譜柱的效果，最終確定流動相組成為2%甲醇乙腈-0.1％磷酸和0.1％三乙胺（25∶75），并以該色譜條件為基礎(chǔ)進行了方法學(xué)考察。

　　本實驗建立了測定三越麻黃顆粒中甘草酸含量的高效液相色譜方法。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法符合《中國藥典》中有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的要求，具有快速靈敏、準(zhǔn)確可靠、簡便易行、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于控制三越麻黃顆粒的質(zhì)量。