xCELLigence系統(tǒng)實時監(jiān)測低毒性X-tremeGENE DNA轉染實驗

 

 

X-tremeGENE DNA Transfection Reagent是一種非脂質體、多組分轉染試劑，已被證明可有效轉染多種細胞。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP在有無血清條件下均可進行轉染，且細胞毒性低，轉染后無需更換培養(yǎng)基。

 

降低轉染試劑本身的脫靶效應是非常重要的：

■   在長時間內保證轉染目標基因的高表達率

■   減少死細胞數(shù)目及其釋放的蛋白酶，能高表達未被消化的目的重組蛋白。

■   獲得同轉染目標基因生物相關的結果

 

本研究中，在Hela細胞上進行了X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HPTransfection Reagent的細胞毒性和轉染效率檢測，并與其他試劑進行了比較。

 

 

■   細胞毒性使用xCELLigence RTCA MP儀器進行檢測，通過測定電阻抗，可長時間、無標記、動態(tài)監(jiān)控細胞生理活動，包括細胞黏附、伸展、增殖、死亡以及其他形態(tài)變化。新推出的配套耗材E-plate VIEW 96每個孔下部有0.5mm透明的窗口，可完成可視化的精微檢查。

 

■  羅氏自動化圖像捕獲和分析系統(tǒng)Cellavista，其為結合可見光和熒光成像優(yōu)點的全自動、高通量精微細胞圖像分析工作站，在實驗中觀測細胞形態(tài)學變化和檢測轉染效率。

 

■  細胞代謝活動可由WST-1細胞增殖試劑盒分析檢測，定量活性細胞的代謝活力。

 

 

■  xCELLigence RTCA MP儀器的連續(xù)監(jiān)測顯示，使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela細胞上轉染GFP表達質粒，與未處理對照組的細胞指數(shù)（Cell Index, CI）值是相似的（圖1）。而其他試劑在轉染5個小時后，細胞指數(shù)值有明顯的下降，表明存在細胞毒性。

圖1: 使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其爭轉染試劑在Hela細胞上轉染GFP表達質粒后，xCELLigence 檢測的細胞指數(shù)變化曲線圖。

圖2：Hela細胞轉染后的形態(tài)�？梢姽鈭D像由Cellavist儀器獲得（10倍放大）

 

■  Cellavist可視化檢測細胞形態(tài)，轉染24h后獲得可見光成像圖。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP轉染的Hela細胞呈現(xiàn)健康狀態(tài)，而其他試劑組則存在大量死亡細胞（圖2）。

 

■  終點法分析，轉染約72h后通過細胞增殖試劑盒WST-1分析確定細胞活性（圖3）。與X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent相比，其他試劑轉染細胞后，顯著降低代謝活力，顯示出細胞毒性效應。

圖3：比較羅氏X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP 與其試劑轉染細胞后，細胞活力的百分比。WST-1試劑盒檢測得出數(shù)值，并以X-tremeGENE 9組結果進行標準化。

 

 

■  為獲得X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其他試劑轉染后，表達GFP的細胞數(shù)目，Cellavista在指定時間點記錄熒光圖像（圖4）。并利用Cellavista圖像分析軟件，根據(jù)GFP陽性細胞面積（熒光圖像）與總的細胞面積（相應的可見光圖像，未顯示）進行定量，數(shù)據(jù)參見圖5。在觀察過程中得出，X-tremeGENE試劑有更高的轉染效率。

圖4 ：X-tremeGENE Transfection Reagent轉染的細胞表達大量GFP。轉染48h后，Cellavista記錄的細胞表達GFP的熒光圖像（10倍放大）。

圖5：GFP表達水平定量。Cellavista分析軟件統(tǒng)計轉染后24h、48h和72h后的轉染效率百分數(shù)（以X-tremeGENE 9 Transfection Reagent轉染24h后獲得的值進行標準化）。

 

 

X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela細胞系的檢測實驗上，表現(xiàn)出低細胞毒性和高DNA轉染效率。xCELLigence RTCA MP也是理想的適合實時檢測試劑特異性效應的儀器。

 

 

 

Hela細胞（ATCC）接種在合適的含附加成分的細胞培養(yǎng)基中，并在37℃，5%CO₂ 濕潤環(huán)境下培養(yǎng)。細胞用胰蛋白酶消化、清洗并接種在E-Plate VIEW 96上。

 

接種24小時后，分別用三種轉染試劑X-tremeGENE 9、X-tremeGENE HP以及其他試劑（LTX和L2K），轉染CMV啟動子的GFP-pcDNA3.1質粒。轉染根據(jù)指導手冊說明，采用各說明書建議的最適DNA與轉染試劑比例。所有實驗重復三次。

 

xCELLigence RTCA MP儀器連續(xù)監(jiān)測實驗全程細胞狀態(tài)（從細胞接種到轉染后三天）。測定每孔50 μl 細胞培養(yǎng)基的值作為背景電阻抗。每孔最終體積調整至100 μl，密度為4000個Hela細胞。接種后，電阻抗以固定時間間隔被測定。細胞指數(shù)（CI）值以轉染時進行標準化。

 

Cellavista系統(tǒng)高通量顯微鏡可在實驗過程中指定時間點進行操作。xCELLigence 系統(tǒng)測定可短暫暫停，E-Plate VIEW 96可轉化進Cellavista系統(tǒng)中。通過10倍物鏡可獲得所有96孔板的可見光和熒光圖像。轉染效率可使用Cellavista軟件分析獲得。獲取圖像后，E-Plate VIEW 96返回xCELLigence RTCA MP儀器中，細胞電阻測定可重新開始。

 

細胞活性可使用WST-1細胞增殖試劑盒(羅氏應用科學)在實驗終點測定（轉染后72小時），參見操作說明。